rna干扰论文：rna干扰 orfv pll3.7载体 check2载体

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1、【关键词】RNA干扰ORFVpll3.7载体Check2载体【英文关键词】RNAinterference(RNAi)ORFVpll3.7vectorCheck2vectorRNA干扰论文：利用RNAi技术建立抗羊传染性脓疱皮炎病毒的细胞株【中文摘要】羊传染性脓疱皮炎(contagiousecthyma)俗称“羊口疮”，是由羊传染性脓疱皮炎病毒(Orfvirus,ORFV)引起的山羊、绵羊等中小反刍动物以及人的一种嗜上皮性、接触性传染病。本病传染性强、发病率高、呈世界性流行，虽为温和性疾病，但是，当病畜

2、口、唇等部位病变严重时，将严重影响其吃奶、采食、吞咽，导致衰弱，甚至死亡，有报道称患病羔羊的病死率高达93%。因此本病的发生给养羊业带来巨大的经济损失，并对人类健康构成威胁。本研究选择ORFV复制所必需的DNA聚合酶及在ORFV的增值过程中起到重要作用的VETF-S和VETF-L基因作为RNA干扰的靶基因。首先，设计该靶基因的扩增引物，经PCR扩增后与Check2载体分别经PmeI和NotI双酶切，酶切后连接产生Check2-靶基因重组质粒。同时，利用公用网站按照RNAi序列设计原则，设计RNAi11

3、个靶点序列，与经XhoI和HpaI双酶切后的pll3.7载体连接产生pll3.7-shRNA质粒。然后，利用磷酸钙法进行pll3.7-shRNA质粒和Check2-靶基因重组质粒两种质粒共转染293T细胞，之后利用双荧光检测系统试剂盒检测其RNA干扰效果。干扰效果最好可达到91.0%。最后，筛选获得可分别表达P-D-3，P-L-2，P-S-2干扰小片段的3株山羊成纤维细胞细胞株。并通过测定病毒滴度、测定靶基因蛋白表达量，对siRNA抵抗病毒感染的效力进行了评估。本研究对今后该病的抗病研究、药物研究以及

4、克隆转基因抗病羊等都有很好的参考和应用价值。【英文摘要】Orf,alsoknowedascontagiousecthyma,whichiscausedbyorfvirus,isacommonepitheliotrophicviraldiseaseofsheep、goatsandwildruminants.Humansarealsosusceptibletoorf.Thediseasewhichhashighinfectivityandmorbidityisfoundthroughouttheworld

5、.Theeatingandswallowingofthesickanimalwillbeseriouslyaffectedbyitsmouthandlip′slesion.Itwasreportedthattheprevalenceoflambmortalitycanbehighupto93%.Thediseasecancausehugeeconomiclossforovinehusbandryandthreatenthehealthofhuman.DNApolymerase、VETF-SandVET

6、F-Lgeneswhichthevirusneededtocopywereselectedasthetargetedgene.Theprimersofthetargetedgeneweredesigned,thenthetargetedgenewereobtainedbyPCR,whichwereconnectedwithCheck2vectordigestedbyPmeIandNotI.Check2-targetedgenevectorswereconstructed．Inaccordancewit

7、hRNAisequencedesignprinciplesinthepublicWebsite,elevenRNAitargetsequencesweredesigned,thenthetargetsequencesofOligoDNAweresynthesizedandannealedtodouble-strandedDNA,whichwereconnectedwithpll3.7vectordigestedbyXhoIandHpaI.Pll3.7-shRNAvectorswereconstruct

8、ed.293Tcellswereco-transfectedbypll3.7-shRNAvectorsandCheck2-targetedgenevector.TheinterferenceratewasassayedbytheDual-GloTMLuciferaseAssaySystem.Andthebestinterferenceratewas91.0%.ThreecelllinesforinhibitingOrfviruswereestablish