flt3靶向短发夹状干扰rna体外转录合成及作用

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1、FLT3靶向短发夹状干扰RNA体外转录合成及作用作者：卢洁，盛光耀，邹湘，方营旗，赵晓明，徐学聚，白松婷，许培荣，王建人【摘要】FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)是一种酪氨酸激酶受体，在大多数急性髓系白血病(AML)患者中持续激活，与患者预后差密切相关。为探讨3种FLT3靶向短发夹状干扰RNA(shRNA)对急性髓系白血病细胞株THP1的沉默效应，设计和体外转录合成3个FLT3靶向shRNA(shRNA1、shRNA2、shRNA3),体外转染THP1细胞;以RTPCR法检测FLT3mRNA水平表达，用流式细胞术、免疫荧光测定法检测FLT3蛋白的表达。结果显

2、示：shRNA1、shRNA3可显著下调FLT3mRNA的表达，其中shRNA1的抑制作用较强。25nmol/LshRNA1转染48小时对FLT3mRNA的抑制率是(72.95±2.07)%，作用可达72小时。5nmol/L及以上浓度的shRNA1对FLT3mRNA表达有下调作用，作用存在量效关系。15nmol/LshRNA1的抑制率是(67.53±0.66)%。FLT3蛋白位于细胞膜上，shRNA1对其有较强的抑制作用，转染72小时蛋白抑制率达(79.67±0.66)%。结论：FLT3shRNA1具有较好的FLT3基因靶向抑制作用，可作为进一步研究该基因作

3、用机制及靶向治疗可能性的工具。【关键词】急性髓系白血病InVitroTranscriptionSynthesisandEffectsofFLT3TargetedShortHairpinRNAAbstractFMSliketyrosinekinase3(FLT3)isareceptoroftyrosinekinasethatisconstitutivelyactivatedinmostofacutemyeloidleukemiapatientsandseemstogiveanadverseprognosis.Inordertoexplorethesilencin

4、geffectofFLT3targetedshorthairpinRNA(FLT3shRNA)onacuteleukaemiacelllineTHP1,threeFLT3shRNAs(shRNA1,shRNA2,shRNA3)invitroandthentransfectedintoTHP1cells.FLT3mRNAiquantitativeRTPCR,FLT3protEinetryandimmunofluorescence.TheresultsindicatedthatFLT3expressionol/LshRNA1ol/Landmoreconc

5、entrationofFLT3shRNA1coulddoRNAlevel,ol/LshRNA1embrance,itsexpressionaltimeofechanismorFLT3targetingtreatment.Keyyeloidleukaemia；FLT3；FLT3shRNA;RNAinterfering；THP1celllineFMS样酪氨酸激酶3(FMSliketyrosinekinase3，FLT3)是Ⅲ型受体酪氨酸激酶(RTK)受体家族的成员，与急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)关系密切［1,2］。大多数A

6、ML细胞表面有FLT3的过表达，而FLT3是AML最常见的单基因突变，约17%-30%的患者有FLT3近膜区串联重复突变(FLT3ITD)，1.6%-7.0%患者有酪氨酸激酶结构域点突变(FLT3TKD)，这和患者临床高白细胞血征、缓解率低、预后差密切相关。FLT3被认为是AML极有前景的治疗靶点，其靶向抑制深受关注［3,4］。然而FLT3与其它Ⅲ型RTK受体同源性高，往往不易获得高选择性抑制剂［5］，且据白血病发生“二次打击模型”表明，AML发生需要两种基因突变的累加，其中之一突变使细胞具增殖和存活优势，之二突变干扰了造血分化和之后的细胞凋亡［6］，FLT

7、3抑制研究也需要与其它靶向抑制协同，所以有必要对FLT3抑制方式和方法进一步探讨。本研究采用体外转录的方法，合成3个FLT3靶向的短发夹状干扰RNA（FLT3smallhairpaininterferingRNA,FLT3shRNA）,体外转染FLT3过表达的AML细胞株THP1，从FLT3的mRNA、蛋白水平评定其干扰效应，以筛选出一条效率高的FLT3干扰靶序列，用于FLT3RNAi质粒载体构建及后续研究。材料THP1细胞株购自中国科学院上海细胞研究所,T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem及CodeBreakerTMsiRNATr

8、ansfectionRe