抗甲型流感病毒短发夹状RNA分子的体外生物合成及功能鉴定

《抗甲型流感病毒短发夹状RNA分子的体外生物合成及功能鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、文章编号：基金项目：重庆市自然科学基金（2004-54-87）SupportedbytheNaturalScienceFoundationofChongqing（2004-54-87）作者简介：郭述良，男，四川省德阳市人，博士，主任医师，主要从事呼吸系感染性疾病发病机制与防治方面的研究，。E-mail:GUOSL999@sina.com收稿日期：2009-02-03；修回日期：2009-03-16抗甲型流感病毒短发夹状RNA分子的体外生物合成及功能鉴定郭述良，罗永艾（重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆400016）摘要：目的制备抗甲型流感病毒短发夹状RNA分子（short

2、hairpinRNA,shRNA），并鉴定其功能。方法针对甲型流感病毒(influenzaAvirus,IAV）核壳蛋白（nucleoprotein,NP）和酸性RNA多聚酶（acidicRNApolymerase,PA）编码mRNA高度保守区序列设计并制备编码shRNA的双链DNA转录模板，分别将其插入pGenesil-1pGenSil-1质粒，构建NP-shRNA和PA-shRNA表达载体，测序正确后，采以T7转录试剂盒制备NP-shRNA和PA-shRNA。将所制备的2种shRNAs分别或联合转入人气道上皮细胞（humanbronchialepithelium,HBE）

3、，然后感染甲型流感病毒（IAV）A/PR8株，通过测定HBE细胞病变效应（cytopathogeniceffect,CPE）、培养上清液病毒滴度以及NP、PAmRNA与蛋白表达水平，评估所制备的shRNAs对IAVA/PR8在HBE细胞中复制的抑制效果。结果编码shRNA的2种双链DNA转录模板序列正确。通过体外转录技术制备的NP-shRNA、PA-shRNA每100μl含量分别为59.4、50.6nmol，纯度均在2.0以上，浓度和纯度均高。与未转染shRNA的对照组比较，NP-shRNA、PA-shRNA、NP-shRNA＋PA-shRNA转染组细胞内NPmRNA分别减少

4、41.7%、44.1%和68.5%，PAmRNA分别减少43.4%、60.9%和73.7%，NP蛋白表达分别降低92.3%、84.0%和91.7%，CPE显着减轻，培养上清液病毒滴度显着下降。结论成功构建了2种抗IAV短发夹RNA分子，所制备的NP-shRNA、PA-shRNA对IAVA/PR8株在HBE细胞中复制有显着的抑制效果。关键词：流感病毒，甲型；短发夹状RNA分子；RNA干扰；实验研究中图法分类号：文献标识码：ABiosynthesizingandFunctionVerificationofShortHairpinRNAtargetingtoInfluenzaAVi

5、rusGUOShu-liang,LUOYong-ai(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)Abstract:ObjectiveThisprojectmainlyinvestigatestheinhibitiveeffectsofshorthairpinRNA(shRNA)biosynthesizedbyinvitrotranscriptiononinfluenzaAvirus(IAV)duplica

6、tioninhumanbronchialepithelium（HBE）cells.MethodsDesigningandbiosynthesizingNP-shRNAandPA-shRNAtargetingtohighlyconservativesequencesofIAVNPmRNAandPAmRNAbyinvitrotranscription.FollowingthetransfectionofNP-shRNAand/orPA-shRNA,HBEcellswereinfectedwithIAVA/PR/8/34H1N1（A/PR8）virus.Cytopathogenic

7、effect(CPE)ofthecells,hemagglutinationassay(HA)and50%tissuecultureinfectivedose(TCID50)titerofA/PR8inculturesupernatants,theexpressionquantityofNPmRNAandPAmRNAbyRT-PCR,andtheexpressionlevelofNPproteinbyWestern-blottingweredeterminedandcomparedinordertoev