靶向线粒体转录因子a大鼠活体rna干扰实验动物模型的建立

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1、靶向线粒体转录因子A大鼠活体RNA干扰实验动物模型的建立作者：林恒　唐春　吴乔　冯春林　张玉君　别平【摘要】目的：在体外构建并筛选出靶向线粒体转录因子A（TFAM）的有效RNA干扰慢病毒载体，用于大鼠整体RNAi实验，观察其对肝组织中目的基因表达的干扰效果。方法：设计4条siRNA序列并合成双链DNAoligo，制备目的基因RNA干扰慢病毒载体，体外感染目的细胞，利用RT-PCR和的表达情况，从而筛选出有效的干扰靶点。构建大鼠活体RNAi动物模型，观察大鼠肝脏中靶基因表达的变化情况。结果：酶切鉴定及测序结

2、果均提示siRNA序列成功连接入载体中。RT-PCR结果提示3号靶点的干扰效率最高，达到了55％左右，靶向RNA干扰慢病毒载体构建成功，能有效抑制目的细胞中线粒体转录因子A的表达。构建的慢病毒载体在大鼠活体内也具有良好的干扰效果。该研究为下一步利用此慢病毒载体进行活体RNA干扰打下了基础。【关键词】靶向线粒体转录因子A·RNA干扰·慢病毒载体·模型，动物·大鼠，）geneandtoselectthemostefficientsmallinterferingRNA（siRNA）tosuppressTFAMi

3、ntargetcells,andtousetheselectedlentivirusvectorinvivoandtoanalyzeitsefficacy.Methods:AccordingtoGenbankinformationofTFAM,foursiRNAanddoublestrandDNAedbyPCRandsequencing,thenitinedbyPCRandhasbeensuccessfullyconstructed.ItcaneffectivelysuppressTFAMexpressi

4、oninvitroandinvivo.　　【KEYitochondrialtranscriptionfactorA·RNAinterference·Lentiviralvector·Rats,itochondrialtranscriptionfactorA，mtTFA，TFAM）的siRNA，并利用慢病毒载体系统将体外实验筛选出的有效siRNA通过门静脉传输至大鼠肝脏，观察其体内的干扰活性，从而构建出大鼠活体RNA干扰实验动物模型，为下一步实验研究打下坚实的基础。　　1　材料与方法　　1.1　动物来源及分

5、组　　　健康-MLV逆转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂均购自美国Promega公司；PCR用试剂、引物购自上海吉凯基因技术有限公司；胰酶购自上海化学试剂公司；胎牛血清、DMEM、RPMI1640及Opti－MEM均购自美国GIBCO公司；脂质体Lipofect2000、总RNA提取试剂Trizol均购自美国Invitrogen公司；山羊抗TFAM、小鼠抗GAPDH、抗山羊IgG、抗小鼠IgG均购自美国Santacruz公司；BCAProtEinAssaykit购自美国HyClone-Pierce公司；EC

6、L-PLUS/kit购自美国Amersham公司。　　1.3　方法　　1.3.1　构建慢病毒载体　　　针对目的基因TFAM的基因序列，利用公用网站按照RNA干扰序列的设计原则，设计了4个siRNA的寡核苷酸序列（命名为target1#、target2#、target3#和target4#，具体序列见表1），并进行慢病毒载体的构建（双链DNA具体序列见表2），然后运用T4连接酶与经过限制性内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ双酶切后的pGC－LV载体连接，用氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞，转化大肠杆菌菌株DH5

7、α，最后挑取阳性克隆进行PCR鉴定并进行测序分析。PCR鉴定阳性克隆的引物信息如下：上游引物：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’，下游引物：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’。　　1.3.2　慢病毒载体包装及滴度测定　　　产毒细胞为293T细胞，将合成好的4个重组慢病毒质粒及辅助包装载体质粒进行高纯度无内毒素抽提，按照Lipofectamine2000使用说明共转染293T细胞。转染8h后更换为完全培养基，48h后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液进行浓缩和收获，将

8、病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，－80℃长期保存。取其中1支进行病毒生物学滴度测定，方法为孔稀释法。具体病毒浓缩收获及滴度测定实验步骤参考　　1.3.6.2　RT－PCR检测肝组织中TFAMmRNA水平表达的变化情况　　　取各组液氮保存的肝组织标本，玻璃匀浆器制成匀浆后用Trizol法抽提组织总RNA，将RNA反转录成cDNA。取1μL作为模板进行PCR反应。TFAM上游引物：5’-TACCCTCGCCTGTCAGCCT