rna干扰分化抑制因子

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1、RNA干扰分化抑制因子作者：曾达武，方明霞，刘豫瑞【摘要】目的研究针对分化抑制因子-1的siRNA(si-Id-1)对人食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞增殖和凋亡影响的可能机制。方法阳离子脂质体法介导si-Id-1转染ESCCTE-1细胞株，倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化并计算转染率，RT-PCR检测Id-1的mRNA表达水平;免疫印迹法检测Id-1的蛋白表达水平;细胞增殖实验检测转染前后TE-1细胞增殖能力变化;流式细胞术检测各组细胞的周期变化和凋亡指数。结果si-Id-1转染前后的TE-1细胞株Id-1的mRNA

2、和蛋白表达水平有明显差异(P<0.05);转染后的TE-1细胞较其亲代细胞增殖能力降低，凋亡程度增强(P<0.05);转染后的TE-1细胞周期停滞在G0/G1期，G1期细胞数增多，S期细胞数减少(P<0.05)。结论利用脂质体将si-Id-1转染至ESCC的TE-1细胞是切实可行的;si-Id-1可以有效沉默TE-1细胞Id-1的表达，从而抑制ESCC细胞增殖。【关键词】抑制因子，免疫;癌，鳞状细胞;食管肿瘤;RNA，小分子干扰;细胞凋亡;细胞增殖在我国，食管癌具有高发病率及高病死率，以手术为主辅以放

3、射治疗或化学治疗的综合治疗可提高患者生存率，但仍有90%的患者死于转移和局部复发[1]，因此寻求新的切实有效的食管癌治疗方法或策略迫在眉睫。分化抑制因子(inhibitorofDNAbindingordifferentiation,Id-1)可在食管癌、肝癌等肿瘤中表达，参与肿瘤血管发生、促进肿瘤生长及转移[2-4];而小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)可有效沉默目标基因，而不影响正常基因[5]。该研究针对si-Id-1对人食管鳞状细胞癌(ESCC)TE-1细胞增殖、凋亡、细胞周期的

4、影响，探讨其对ESCC增殖和凋亡影响的可能机制。　　1材料与方法　　1.1主要试剂Id-1-siRNA、Lipofectamine2000(广州锐博生物公司)，人食管鳞状细胞癌ESCCTE-1细胞(上海拜力生物公司，ATCC来源)，TrizolReagent(美国Invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒(美国Fermentas公司)，兔抗人Id-1多克隆抗体、I1640培养液，于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。以105mL-1的细胞密度接种培养，细胞80%融合后，用Lipo

5、fectamine2000转染试剂进行转染。3组siRNA均由广州锐博生物公司设计与合成。　　Si-Id-1-001(19bp)：　　5'-UGAGCAAGGUGGAGAUUCUdTdT-3'　　3'-dTdTACUCGUUCCACCUCUAAGA-5'　　Si-Id-1-002(19bp)：　　5'-CAUGAACGGCUGUUACUCAdTdT-3'　　3'-dTdTGUACUUGCCGACAAUGAGU-5'　　Si-Id-1-003(19bp)：　　5'-GUUGGAGCUGAACUCGGAAdTdT-3'　　

6、3'-dTdTCAACCUCGACUUGAGCCUU-5'　　另外，本实验还将标记FAM的siRNA同时转染至TE-1细胞，分别于转染6，24，48和60h后通过荧光倒置显微镜观察含有荧光的细胞所占比例以及转染前后的细胞形态变化，据此估计siRNA的转染效率。　　1.3.2RT-PCR检测Id-1的mRNA表达用Trizol一步法提取TE-1细胞总RNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测纯度并定量。然后以mRNA为模板，Oligo(dT)18为引物，逆转录成cDNA，反应总体积为20μL，RT-PCR反应条件为

7、42℃孵育60min，70℃中止10min。Id-1的PCR反应引物由上海生物工程公司设计和合成，扩增片段大小为416bp。　　上游引物(Id1-P1)：　　5'-CAGCACGTCATCGACTACATCA-3'　　下游引物(Id1-P2)：　　5'-GAATCCCACCCCCTAAAGTCTC-3'　　以β-肌动蛋白(β-actin)的一段扩增序列为内对照，扩增片段大小为556bp。　　上游引物(β-actin-P1)：　　5'-AAAGACCTGTACGCCAACACAG-3'　　下游引物(β-actin-P2)

8、：　　5'-TTTTAGGATGGCAAGGGACTTC-3'　　反应体系：1×PCRBuffer，dNTP0.2mmol/L，cDNA模板200ng，引物浓度0.4μmol/L，Taq酶1.25U，反应总体积25μL。反应条件：94℃预变性5min;94℃30s→57℃30s→72℃45s，共30个循环;72℃最后延伸7min。