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时间:2018-11-11
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1、FLT3靶向短发夹状干扰RNA体外转录合成及作用作者:卢洁,盛光耀,邹湘,方营旗,赵晓明,徐学聚,白松婷,许培荣,王建人【摘要】FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)是一种酪氨酸激酶受体,在大多数急性髓系白血病(AML)患者中持续激活,与患者预后差密切相关。为探讨3种FLT3靶向短发夹状干扰RNA(shRNA)对急性髓系白血病细胞株THP1的沉默效应,设计和体外转录合成3个FLT3靶向shRNA(shRNA1、shRNA2、shRNA3),体外转染THP1细胞;以RTPCR法检测FLT3mRNA水平表达,用流式细胞术、免疫荧光测定法检测FLT3蛋白的表达。结果显
2、示:shRNA1、shRNA3可显著下调FLT3mRNA的表达,其中shRNA1的抑制作用较强。25nmol/LshRNA1转染48小时对FLT3mRNA的抑制率是(72.95±2.07)%,作用可达72小时。5nmol/L及以上浓度的shRNA1对FLT3mRNA表达有下调作用,作用存在量效关系。15nmol/LshRNA1的抑制率是(67.53±0.66)%。FLT3蛋白位于细胞膜上,shRNA1对其有较强的抑制作用,转染72小时蛋白抑制率达(79.67±0.66)%。结论:FLT3shRNA1具有较好的FLT3基因靶向抑制作用,可作为进一步研究该基因作
3、用机制及靶向治疗可能性的工具。【关键词】急性髓系白血病InVitroTranscriptionSynthesisandEffectsofFLT3TargetedShortHairpinRNAAbstractFMSliketyrosinekinase3(FLT3)isareceptoroftyrosinekinasethatisconstitutivelyactivatedinmostofacutemyeloidleukemiapatientsandseemstogiveanadverseprognosis.Inordertoexplorethesilencin
4、geffectofFLT3targetedshorthairpinRNA(FLT3shRNA)onacuteleukaemiacelllineTHP1,threeFLT3shRNAs(shRNA1,shRNA2,shRNA3)invitroandthentransfectedintoTHP1cells.FLT3mRNAiquantitativeRTPCR,FLT3protEinetryandimmunofluorescence.TheresultsindicatedthatFLT3expressionol/LshRNA1ol/Landmoreconc
5、entrationofFLT3shRNA1coulddoRNAlevel,ol/LshRNA1embrance,itsexpressionaltimeofechanismorFLT3targetingtreatment.Keyyeloidleukaemia;FLT3;FLT3shRNA;RNAinterfering;THP1celllineFMS样酪氨酸激酶3(FMSliketyrosinekinase3,FLT3)是Ⅲ型受体酪氨酸激酶(RTK)受体家族的成员,与急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)关系密切[1,2]。大多数A
6、ML细胞表面有FLT3的过表达,而FLT3是AML最常见的单基因突变,约17%-30%的患者有FLT3近膜区串联重复突变(FLT3ITD),1.6%-7.0%患者有酪氨酸激酶结构域点突变(FLT3TKD),这和患者临床高白细胞血征、缓解率低、预后差密切相关。FLT3被认为是AML极有前景的治疗靶点,其靶向抑制深受关注[3,4]。然而FLT3与其它Ⅲ型RTK受体同源性高,往往不易获得高选择性抑制剂[5],且据白血病发生“二次打击模型”表明,AML发生需要两种基因突变的累加,其中之一突变使细胞具增殖和存活优势,之二突变干扰了造血分化和之后的细胞凋亡[6],FLT
7、3抑制研究也需要与其它靶向抑制协同,所以有必要对FLT3抑制方式和方法进一步探讨。本研究采用体外转录的方法,合成3个FLT3靶向的短发夹状干扰RNA(FLT3smallhairpaininterferingRNA,FLT3shRNA),体外转染FLT3过表达的AML细胞株THP1,从FLT3的mRNA、蛋白水平评定其干扰效应,以筛选出一条效率高的FLT3干扰靶序列,用于FLT3RNAi质粒载体构建及后续研究。材料THP1细胞株购自中国科学院上海细胞研究所,T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem及CodeBreakerTMsiRNATr
8、ansfectionRe
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