携带人hcn4和tbx3基因慢病毒载体的构建

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1、摘要摘要目的：目前治疗缓慢心律失常的病窦综合症(sss)，临床上主要采用植入永久性电子起搏器治疗，但由于存在许多缺陷，使人们一直在寻找更好治疗方法。HCN4基因属于超级化激活环核苷酸门控阳离子通道基因家族，国内外动物试验均证实了利用干细胞载体经HCN4修饰后治疗缓慢心律失常的可行性。TBX3(T-box3)基因是T-box基因家族的成员之一，该家族属发育调控相关转录因子，参与细胞的发育形成，细胞增殖调控，衰老和凋亡，在心脏传导系统的形成中起关键作用。现以HCN4基因转染小鼠胚胎干细胞ES后植入心脏，虽能分化成心肌样细胞，但缺乏窦房结标记基因且功能上与窦房结细胞仍有差距，同时基于Tbx

2、3对窦房结细胞表型和功能上的重要作用，故本实验主要构建携带窦房结转录基因Tbx3和起搏基因HCN4双基因慢病毒载体，为下步转染干细胞做准备，希望将来可以获得起博性能稳定耐久的新型生物起搏器，进而为其将来临床应用奠定基础。方法：1、设计4组慢病毒载体质粒Lentiviral—HCN4+Tbx3一EGFP，Lentiviral—HCN4．EGFP，Lentiviral．Tbx3一EGFP和Lentiviral—EGFP，由于已经有Lentiviral—EGFP质粒(购自广州赛耶公司)，故构建前3种质粒。2、寻找HCN4和TBX3基因的分段酶切位点，把目的基因均分成前后2个片段，Cyage

3、n公司设计并合成目的基因各小片段的引物。3、采用重叠PCR的方法得到HCN4和TBX3基因前后2段基因片段，以及HCN4(后端)和TBX3(前端)的连接片段。4、应用GatewayTechnologyBP反应构建入门载体HCN4(后端)，TBX3(前端)和HCN4(后端)．TBX3(前端)，其产物转化细菌感受态细胞，菌落鉴定和酶切鉴定结果后对阳性克隆进行测序。5、NdeI／ScaI双酶切入门载体HCN4(前端)得到小片段基因HCN4(前端)后插入到已双酶切的大片段骨架HCN4(后端)和HCN4(后端)一TBX3(前端)摘要中，构建含有HCN4全长的入门载体HCN4(全长)和HCN4(

4、全长)．TBX3(前端)，其产物转化细菌感受态细胞，酶切鉴定后对阳性克隆进行测序。6、EcoRI酶切入门载体TBX3(后端)得到小片段基因插入已EcoRI酶切的入门克隆TBX3(前端)和HCN4(后端)．TBX3(前端)得到含有TBX3全长的入门载体TBX3(全长)和HCN4(全长)一TBX3(全长)，其产物转化细菌感受态细胞，酶切鉴定后对阳性克隆进行测序。7、模板载体质粒pLV．EX2d．null，入门载体质粒，Pup．CMV质粒进行GatewayTechnologyLR反应构建最终慢病毒载体HCN4(全长)一TBX3(全长)、HCN4(全长)和TBX3(全长)，转化反应产物到St

5、bl3感受态细胞，菌落PCR鉴定及对阳性结果测序。结果：1、本实验成功扩增出基因片段attB1。NdeI—ScaI—HCN4(后端)一T2A—TBX3(前端、)一EcoRI—attB23．3KB，attBl一NdeI．hHCN4(后端)／T2A／eGFP．attB22．1KB，attBl一Kozak．TBX3(前端)一EcoRI．attB21．1KB，EcoRI．TBX3(后端)一P2A．eGFP—EcoRI2．2KB。2、BP反应得到入门载体pDown．NdeI．ScaI—HCN4(后端)．T2A—TBX3(前端)．EcoRI后用NdeI／EcoRI双酶切进行鉴定，得到所需目的条带

6、HCN4(后端)一T2A—TBX3(前端)3．3KB；菌落鉴定pDown-hHCN4(后端)／T2A／eGFP和pDown．TBX3(前端)．Eco对得到目的条带hHCN4(后端)2．1KB和TBX3(前端)1．1KB。3、NdeI／ScaI双酶切和T4连接反应得到入门克隆pDown．tatCN4(全长)／T2A／TBX3(前端)一EcoRI和pDown—hHCN4(全长)／T2A／eGFP，NdeI／ScaI双酶切鉴定得到目的条带hHCN4(前端)1．4KB。4、EcoRI酶切和T4连接反应得到入门克隆pDown．hHCN4(全长)／T2A／TBX3(全长)和pDown—TBX3(

7、全长)／P2A／eGFP，EcoRI酶切鉴定得到TBX3(后端)2．2KB。5、LP反应得到pLV．EX2d．null—CMV>hHCN4／T2A／TBX3／P2～eGFP，pLV．EX2d．null—CMV>TBX3／P2A／eGFP，pLV．Des2d．null—CMV>hHCN4／T2A／eGFP，菌落PCR鉴定3种慢病毒质粒都得到所需CMV条带640BP。结论：在本课题中，我们用重叠PCR方法成功分段融合扩增得到人HCN4与TBX31II摘要基因前