携带afp基因慢病毒载体制备并感染树突状细胞的实验研究的论文

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1、携带AFP基因慢病毒载体制备并感染树突状细胞的实验研究的论文【摘要】目的:制备携带afp基因的慢病毒,并体外感染树突状细胞(dc),制备afpdc疫苗。方法:以人hepg2肝癌细胞cdna为模板pcr扩增出afp基因片段,将该片段克隆入慢病毒载体,构建成lentiafp慢病毒载体。其后,用慢病毒载体转染293t细胞,包装慢病毒表达载体。通过酶切、pcr对lentiafp慢病毒载体进行鉴定。包装好的慢病毒体外感染dc,制备afpdc疫苗,流式细胞仪检测感染率,免疫荧光、rtpcr法及电化学发光

2、法检测afp表达。结果:酶切、pcr鉴定证实,慢病毒载体插入片段为afp基因。包装的慢病毒具有良好的感染性,可以在293t细胞中形成病毒颗粒,携带afp基因的慢病毒感染dc,经免疫荧光、rtpcr法及电化学发光法证实dc能够表达转染基因afp,并且不会影响dc表型,感染率高达78.91%。结论:成功构建携带afp基因的慢病毒载体,感染树突状细胞后表达afp,为dc疫苗在肝癌中的临床应用提供了实验基础。【关键词】甲胎蛋白;慢病毒;基因转染;树突状细胞甲胎蛋白(alphafetoprotein,afp

3、),是一种重要的胚胎期及肝癌相关蛋白,正常情况下新生儿出生后,afp表达即被关闭。但如果肝细胞发生癌变或发生化学或物理损伤时,afp基因又可重新表达。afp的表达量异常增高,临床上可作为肝癌的一个诊断和预后指标。.cOm因此,制备afp特异性的疫苗,诱导针对afp的特异性的免疫反应,可作为肝细胞癌治疗的一种新思路。树突状细胞(dendriticcell,dc)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞,它能够高效的摄取、处理抗原,并将处理后的多肽呈递给静息型t细胞,引起针对该抗原的特异性免疫反应。dc应用于肝

4、癌免疫治疗是目前的研究热点,用afp基因修饰dc,一些方法被证实有效[1,2]。本研究中,我们构建了人afp慢病毒表达载体,并应用该载体感染dc,制备afpdc疫苗,为dc疫苗在肝癌中的临床应用提供实验基础。　　1材料和方法　　1.1材料慢病毒载体系统(tronolab)由中国科学院上海生化细胞所提供,该病毒包装系统为四质粒系统,组成为prsvrev、pmdlgprre、pmd2g、pod2,其中载体质粒pod2能表达绿色荧光蛋白(gfp)、prsvrev、pmdlgprre,pmd2g含有

5、病毒包装所必须的元件。限制性内切酶bamhⅰ、salⅰ购自takara公司。包装细胞293t细胞株购自atcc,高感受态dh5α购自博大泰克公司,转染用试剂trizol、lipofectamine2000、胎牛血清、胰蛋白酶均购自invitrogen公司。il4、gmcsf及tnfα购自bioscience公司,afp肿瘤标志物检测试剂盒购自罗氏公司,人肝癌细胞系hepg2为我科保存。　　1.2方法　　1.2.1pcr方法获取基因片段根据afp基因信息设计基因合成引物:上游引物5′端带有bamh

6、ⅰ切点,下游引物5′端带有salⅰ切点,上游5′atttggatcccgccaccatgaagtgggtggaatcaat3′,下游5′agacgtcgactcattaaactcccaaagcagc3′。根据说明书用trizol试剂从人hepg2肝癌细胞中抽提总rna,并利用rtpcr反转录成cdna,以该cdna为模板利用上述引物做pcr扩增得到afp基因片段。pcr反应体系为:模板1μl,10×labuffer2μl,dntp2μl,kodplus1.0μl,primers1.0μl

7、,h2o加至20μl反应体系。pcr反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性45s、52℃退火45s和68℃延伸90s,循环数35,最后经72℃总延伸10min。目的产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收,获得afp基因片段。　　1.2.2慢病毒载体lentiafp的构建及酶切鉴定将pcr产物全部进行凝胶电泳后回收,对慢病毒空载体pod2和pcr的回收产物分别用bamhⅰ和salⅰ进行双酶切,酶切目的片段用dna纯化试剂盒进行纯化,再用t4连接酶将双酶切载体和目的基因片段进行连接反应。取5μl连接产物转

8、化入dh5α高效感受态细胞,在含氨苄青霉素的lb平板上37℃培养过夜。经pcr及bamhⅰ和salⅰ双酶切鉴定后筛选出正确阳性克隆,最后取一个正确连接的质粒送出测序进一步确认,即lentiafp。　　1.2.3lentiafp慢病毒的制备用磷酸钙法转染293t细胞制备lentiafp慢病毒。将处于对数期生长的密度为2.5×106/l293t细胞接种于的10cm细胞培养皿中,37℃、50ml/lco2培养箱内培养,24h后,当细胞密度达60%～70%