RNA干扰RelB慢病毒载体的构建及其诱导骨髓致耐受树突状细胞的实验研究

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1、南方医科大学博士学位论文RNA干扰RelB慢病毒载体的构建及其诱导骨髓致耐受树突状细胞的实验研究姓名：包杰申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：王前20070312中文摘要扩增技术的基础上，采用最近发展的RNAi技术(RNAinterference，RNAi)针对影响DC发育成熟的关键基因NF．KB／RelB进行干预，筛选出于扰效率最高的shRNA，包装成慢病毒，感染骨髓DC(BonemarrowderivedDC。BM．oc)，获得RNAiRelBDC，并对RelB基因沉默的BM．DC进行形态学、表型和免疫功能的鉴定，以期

2、构建出RP旧基因沉默的新型致耐受DC．即RNAi＆旧DC，研究其在T细胞免疫耐受诱导中的可能机制，为成功应用这种新型DC治疗移植排斥反应及自身免疫病提供一定的理论依据。方法：1、小鼠骨髓DC的体外培养和鉴定：无菌分离C57BL／6小鼠骨髓前体细胞，在低剂量的重组小鼠粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子(rmGM—CSF)和重组小鼠白细胞介素．4(maiL．4)作用下，经轻柔手法筛选并结合CDIlc+免疫磁珠分选方法，培养扩增骨髓来源DC(BM．DC)，并利用脂多糖(LPS)于细胞培养结束前24h刺激诱导DC成熟。实验分两组：①对照组DC(Contr

3、01．DC)：经手法筛选后免疫磁珠分选体外培养第6天的DC，即未成熟DC；②脂多糖刺激DC组(LPs．DC)：在培养结束前24h终浓度为Igg／mL的LPS刺激DC，即成熟DC组。并在细胞形态、细胞表面分子表达和同种混合淋巴细胞反应(allogenicmixedlymphiereaction)免疫功能以及RP旧基因表达水平等方面进行检测和鉴定。2、RNA干扰如腰基因慢病毒载体的构建与鉴定：根据不同成熟状态的骨髓DC表达RP坍基因水平的不同，我们利用https：／／maidesigner．invitrogen．com／maiexpress／在

4、线软件设计2个位点的RelB干扰序列。采用U6慢病毒表达载体系统构建目标基因RelB的慢病毒shRNA表达载体，经测序验证，在293FT细胞中包装病毒粒子，病毒包括3种，目标基因RP馏的R2和R5以及阴性对照T6。分别对这3个病毒粒子进行滴度测定。采用体外培养第4天的骨髓来源的未成熟DC进行感染，利用RT-PCR和免疫荧光染色方法进行各感染组的RelB表达水平检测。同时设置未成熟DC对照组。Ⅱ博士学位论文3、骨髓致耐受树突状细胞的诱导及免疫功能研究：在有效沉默BM．DC表达&腰的基础上，进一步探讨RelB沉默的BM．DC的生物免疫学功能。实

5、验设4组：①未成熟DC对照组；②LPS刺激成熟DC对照组；(萤RelB沉默的BM．DC组；@LPS刺激RelB沉默的BM．DC组。分别对这4组DC的形态、表面分子表达和细胞免疫功能(IL．12分泌水平、Thl／Th2细胞因子分泌、混合淋巴细胞反应等)方面探讨RP馏沉默的BM．DC的生物免疫学功能。结果：l、在低剂量的rmGM．CSF和rm．IL．4的诱导下，成功地诱导出大量的骨髓DC，每2只小鼠获得BM．DC约l～2×107，基本上可满足实验需要。手法筛选的BM．DC的CDllc阳性细胞达70％，结合免疫磁珠分选后CDllc阳性细胞的可获得

6、90％以上纯度的BM．DC。经流式细胞术鉴定，对照组DC(ControlDC)低水平表达MHC．II类分子、CD86和CD40，符合未成熟DC的特点，视为未成熟DC组；脂多糖刺激DC组(LPS．DC)高水平表达MHC．II类分子、CD86和CIM0，符合成熟DC的特点，视为成熟DC组。对上述2组的细胞形态学观察也显示ControlDC细胞形态多为圆形，表面多褶皱，突起较少，细胞器较少，但细胞内含有较多的吞饮泡样结构；而LPS．DC细胞内囊泡样结构较少，细胞内线粒体和粗面内质网等细胞器丰富，细胞质回缩，突起明显。对DC分泌m．12的水平的EL

7、ISA结果显示，ControlDC的IL．12分泌水平显著低于LPS．DC(p(o．01)。刺激同种异基因T细胞增殖(MLR)(P《0．01)以及RelB基因表达水平的研究也得到了类似的结果。2、设计合成2个位点的RelB基因(NM009046)，行95℃退火处理，经4％琼脂糖凝胶电泳检测得到了退火产物dsOligo，将该产物与pENTR7M加6连接，转化TOPl0感受态细胞，卡那霉素抗性(5似g／mE)平板筛选阳性克隆，U6前引物(5’．GGACTATcATATGCTl’AcCG．3’)测序结果显示获得了阳性克隆。将目标基因阳性克隆质粒与

8、慢病毒载体进行重组，转化Stbl3感受态细胞，氨ⅡI中文摘要苄青霉素(Amp)抗性筛选后，进行30#g／mL氯霉素的LB平板中的药物负筛选，U6前引物测序再次表明2个位点的重组子