人livinα基因重组腺病毒感染树突状细胞抗lewis肺癌的免疫学研究

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1、华中科技大学博士学位论文人livinα基因重组腺病毒感染树突状细胞抗Lewis肺癌的免疫学研究中文摘要第一部分携带人livinα基因重组腺病毒载体的构建与鉴定[实验背景]Livin基因是近年来发现的一种新的抗凋亡基因，它有两种剪接异构体分别命名为livinα和livinβ。由于livin的抗凋亡活性以及其在多数肿瘤组织中高表达，在大多数正常成人组织中含量甚微或不表达的特点，使得它有可能成为肿瘤免疫治疗的良好靶点，因此针对livin抗原为靶抗原构建以树突状细胞（Dendriticcells，DCs）为基础的肿瘤疫苗可能具有良好应用

2、前景。近年来，随着体外分离和培养DCs技术的完善，把肿瘤抗原或基因导入DCs中制成DCs疫苗进行抗肿瘤免疫治疗研究已倍受关注，而有效的基因转移方式是抗肿瘤免疫治疗的关键。利用重组腺病毒载体（recombinantadenovirus，rAd）介导目的基因转入DCs是实现基因转移的有效方法。本部分研究旨在通过AdMax系统构建携带人livinα基因和增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）基因的重组腺病毒,为下一步感染DCs制成DCs疫苗进行抗肿瘤免疫治疗研究奠定基础。[实验目的

3、]利用AdMax系统构建携带人livinα基因和增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组腺病毒载体(rAd-hlivinα)。[实验方法]以质粒pIRES2-EGFP-hlivinα为模板，通过PCR扩增出人livinα基因cDNA片段，再将人livinα基因cDNA亚克隆于腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv，获得重组腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv-hlivinα。此重组质粒经双酶切及插入片段测序鉴定，将鉴定正确的重组腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv-hlivinα与腺病毒辅助质粒3华中科技大学

4、博士学位论文pBHGlox(delta)E1,3Cre通过脂质体2000共转染HEK293细胞，两质粒在HEK293细胞中同源重组获得重组腺病毒rAd-hlivinα，PCR鉴定此病毒后，将鉴定正确的重组腺病毒在HEK293细胞中扩增，制备高滴度病毒液，用TCID50法测定病毒滴度。[实验结果]结果显示，双酶切重组腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv-hlivinα结果符合预期片断大小，插入片段测序结果符合Genebank中报告的人livinαcDNA序列。感染的HEK293细胞内能观察到重组腺病毒rAd-hlivinα

5、绿色荧光蛋白的表达。rAd-hlivinα10经PCR鉴定特异性的扩增出符合预期大小的片断。病毒滴度为2.7×10TCID50/毫升。[实验结论]通过AdMax系统成功构建了重组腺病毒rAd-hlivinα，且达到较高滴度。这是首次报道利用AdMax系统构建携带人livinα基因和报告基因EGFP的重组腺病毒载体，为下一步开展DCs疫苗的肿瘤免疫治疗实验奠定了基础。[关键词]基因转移；livinα；重组腺病毒；增强的绿色荧光蛋白（EGFP）.4华中科技大学博士学位论文第二部分重组腺病毒介导人livinα基因修饰的小鼠DCs疫苗的

6、构建与鉴定[实验背景]树突状细胞（dendriticcells，DCs）是目前已知人体内专职的、最强的抗原递呈细胞（antigen-presentingcell，APC）,它能同免疫反应系统中的许多细胞相互作用，处于免疫反应的中心地位，能够激活机体先天性和获得性免疫应答反应，其通过向T淋巴细胞提呈抗原，诱发细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicTlymphocyte，CTL）效应而发挥抗肿瘤免疫作用。目前，以DCs为基础的肿瘤疫苗在动物和临床研究中取得了许多进展，已成为肿瘤免疫治疗的热点之一。利用肿瘤抗原基因修饰DCs制成DCs

7、疫苗来诱导机体产生抗肿瘤免疫反应已成为肿瘤免疫治疗的一条重要途径，而其中应用复制缺陷型重组腺病毒载体把目的基因转入小鼠或人DCs中，是实现基因转移的有效方式，也是基础研究中广泛应用的载体。到目前为止，腺病毒介导的基因治疗是最有前途的治疗方法之一。本部分研究中将利用在第一部分成功构建的重组腺病毒rAd-hlivinα载体，将人肿瘤抗原基因livinα通过重组腺病毒转入小鼠骨髓DCs中，制备人livinα基因修饰的DCs疫苗，为后续针对小鼠肺癌治疗的免疫学研究提供实验基础。[实验目的]将人livinα基因通过重组腺病毒载体转入小鼠骨

8、髓DCs中，实现人livinα在DCs中高效表达，制备人livinα基因修饰的DCs疫苗。[实验方法]1.用淋巴细胞分离液体外分离C57BL/6小鼠骨髓单个核细胞，加入含有20纳克/毫升GM-CSF和10纳克/毫升IL-4的RMPI1640完全培养基体外诱导培养