e型沙眼衣原体momp基因重组腺病毒及其转染树突状细胞免疫效果的研究

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2、索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：占翌。导师签名：山东大学博十学位论文E型沙眼衣原体MOMP基因重组腺病毒及其转染树突状细胞的免疫效果研究专业：病原生物学博士生：吕慧导师：赵蔚明教授中文摘要沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，Ct)泌尿生殖道感染是当今世界上最常见的性传播疾病(sTD)。据WHO统计，全球每年新感染约l千万例，每年耗资约40亿～50亿美元，仅次于HW感染。衣原体持续性感染可导致女性慢性盆腔炎、不孕和异位妊娠等严重并发

3、症。Ct生殖道感染还能提高HIV和高危型HPV传播的机率。虽然抗生素可用于治疗衣原体生殖道感染，但由于无症状性衣原体感染普遍存在，给预防Ct的感染和并发症带来很大困难。因此研制安全有效的疫苗是控制泌尿生殖道Ct感染的最好方法。人们最早试验用紫外线或热处理灭活的完整Ct原体做疫苗，在人体试验中仅取得局部、短时的保护效应，而且在部分个体可能导致机体对某种Ct抗原发生病理反应。因此目前的衣原体疫茁研究主要以Ct蛋白抗原为基础。衣原体主要外膜蛋白(Majoroutcrmembraneprotein，MOMP)是引起宿主免疫反应的主

4、要靶抗原，目前多数疫苗的研究均以鼠型沙眼衣原体(C．mufidarum，以往称为MoPn)的MOMP为研究对象，包括亚单位疫苗、重组疫苗、DNA疫苗、树突状细胞疫苗等，均处在动物实验阶段，且免疫保护效果差异较大。鼠型沙眼衣原体并非人的天然病原体，人型沙眼衣原体D～K血清型是引起人类泌尿生殖道感染的主要病原体。人型沙眼衣原体与鼠型沙眼衣原体在生物学特性及致病特征上均存在一定差异。在人ct的19个血清型中，E型为国内外最流行的血清型，占全部衣原体感染的40％以上。E型ct流行较广的原因可能是E型具有某些生物学优势，从而增强了它

5、们感染、传播和潜伏在宿主中的能力。与鼠型沙眼衣原体相比，感染人的Ct尤其是E型Ct对小鼠的毒力较弱，因此目山东人学博l：学位论文前有关人Ct的疫苗研究较少。‘Darville等(1997)建立了E型Ct生殖道感染C57BL／6和C3H／HeN小鼠的模型；最近国内王红枫等(2006)成功建立了E型Ct的BALB／c小鼠生殖道感染模型，为我们选择E型Ct作为研究对象提供了可行性。为探索新型的沙眼衣原体疫苗，我们以E型CtMOMP为研究对象，进行了以下研究：一．含E型CtMOMP基因的重组腺病毒和DNA疫苗的构建寻找有效的辅佐运

6、载系统是衣原体疫苗研制的重要目标。由于E型Ct自生殖道粘膜入侵感染，研制能有效激发局部粘膜免疫反应的疫苗显得尤为重要。复制缺陷型重组腺病毒嗜性广泛，能感染包括粘膜上皮细胞在内的多种细胞，介导外源基因在细胞内的稳定表达，并可通过类似天然感染的鼻腔接种途径在局部粘膜以及远端生殖道粘膜表面诱发特异性免疫反应；且病毒基因不与受体细胞基因组发生整合，具有良好的生物安全性，是较理想的Ct候选疫苗。DNA疫苗刺激机体免疫系统的方式与自然感染病原体的方式非常接近，具有其他疫苗不可比拟的优势而受到普遍重视。为此我们与加拿大曼尼托巴大学医学微

7、生物系合作，从E型Ct基因组中扩增出MOMP基因，在国内外首次构建了含E型CtMOMP基因的重组腺病毒Ad—MOMP及重组真核表达质粒pVAXl一MOMP，为进一步动物免疫及有关蛋白生物学功能的实验奠定了基础。首先，根据Genebank中E型CtMOMP基因序列设计引物，用高保真PCR方法从E型ct基因组DNA中扩增得到MOMP基因片段，克隆至pcDNAII载体，测序后连接入腺病毒穿梭载体pDC316，经酶切鉴定及PCR测定证实pDC316一MOMP重组质粒构建正确。穿梭载体pDC316．MOMP与含腺病毒Ad5大部分基因

8、组的辅助质粒PBHGIoxAEl，3Cre共转染至HEK293细胞，在Cre-loxP重组酶作用下进行重组，包装成重组腺病毒颗粒。用PCR技术证实重组腺病毒含有E型CtMOMP基因，RT-PCR证实重组腺病毒在感染的293细胞能有效转录MOMP基因，Westernblotting检测到MOMP基因在29