用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒t细胞抗淋巴瘤免疫效应论文

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1、用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T细胞抗淋巴瘤免疫效应论文朱雄鹏，陈志哲，胡建达，李纯团，杨婷，许贞书【摘要】本研究探讨转染survivin(SVV)基因的树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗淋巴瘤的免疫效应。对人外周血DC进行诱导培养，以AdSVV转染DC，用LR)easuretheabilitytoproleferateallolymphocytebyDCs,ELISAedbyLRassay,DCstransfectedphocytesreactionattheratiosof1∶5,1∶10

2、,1∶50and1∶100.DCstransfecteduchhigheractivityofCTLtoCA46cellsthancontrolDCs.ThelevelsofIL12ofsupernatantscontainingDCstransfectedphomacells.Keyphoma;cytotoxicTcell;immunotherapy树突状细胞(dendriticcell,DC)作为机体内功能最强的专职抗原呈递细胞(APC)，在激活T细胞介导的免疫反应中起关键性作用，而survivin（存活蛋白，SVV）

3、基因是肿瘤组织较为特异的基因，其编码的蛋白survivin成为肿瘤较理想的靶抗原之一。因此，我们以重组腺病毒介导SVV基因修饰DC，观察诱导产生的特异性抗淋巴瘤免疫效应，为以DC为基础肿瘤免疫治疗提供实验依据。材料和方法材料表达survivin蛋白的重组腺病毒（AdSVV）由本所构建、包装［1］，滴度为：AdSVV2.65×109pfu/ml；恶性淋巴瘤细胞株CA46为本室保存株。总蛋白裂解酶、蛋白酶抑制剂为美国Pierce公司产品；兔抗人survivin多克隆抗体为北京中杉生物技术公司产品；辣根标记山羊抗兔IgG、OI

4、为100加入重组腺病毒，分为3组：转染AdSVV的DC组(AdSVVDC)、空载体转染DC组（AdCMVDC）和未转染DC组（NDC），并补充生长因子GMCSF、IL4（终浓度均为1000U/ml）。于37℃5%CO2，培养箱继续培养48小时(第9天)收集细胞。Survivin蛋白表达的LR)测定取培养第9天的AdSVVDC和NDC，分别加入丝裂霉素C，使其终浓度为50μg/ml，在37℃，5%CO2的培养箱中培养45分钟，作为刺激细胞。分别以2×104/孔、1×104/孔、2×103/孔、1×103/

5、孔将DC加入96孔板中，以T淋巴细胞供者自身的PBMC为对照组，每组设3个复孔。每孔均加入1×105的T淋巴细胞，刺激反应细胞之比（S/R）分别为1∶5，1∶10，1∶50，和1∶100，终体积200μl，于37℃，5%CO2的培养箱中培养96小时。终止培养前4小时加入MTT20μl（5mg/ml），培养终止后加DMSO200μl，充分混匀后静置。选择波长为570nm处测OD570值。计算刺激指数（SI），结果以3孔的均值表示。刺激指数（SI）=实验孔OD均值/对照孔OD均值CTL细胞体外杀伤活性的检测效应细胞的制备取培养第

6、9天的AdSVVDC组细胞和NDC组细胞各5×105，作为刺激细胞，加入到24孔培养板中，按5×106/孔加入经T细胞尼龙毛柱分离的T淋巴细胞（反应细胞）；同时以不与DC共孵育的自体淋巴细胞为对照，每组设3个复孔。加入IL2（500U/ml），于37℃、5%CO2的培养箱培养。以后隔天半量换液，并补充IL2，继续培养至第14天，作为效应细胞。CTL的活性测定以1×104∕孔加靶细胞（CA46）到96孔板中，再分别按5∶1、10∶1、20∶1（效应细胞∶靶细胞）加效应细胞到各孔中，每组设3个复孔。同时设4个对照:靶细

7、胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组。按Cytotox96NonRadioactiveCytotoxicityAssay试剂盒说明书检测CTL反应，以对靶细胞的杀伤率表示CTL活性。细胞杀伤率(%)=［（实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放）/（靶细胞最大释放-靶细胞自发释放）］×100%细胞因子的检测收集培养AdSVVDC以及NDC的当天、第2天、第4天上清，按试剂盒说明书方法进行IL12含量检测。统计学处理本实验数据应用SPSS11.5统计软件进行方差分析。结果存活蛋白的表达经:mark

8、er.Lane1:AdCMVtransfectedDC.Lane2:AdSVVtransfectedDC.刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力在不同的S/R（刺激细胞/应答细胞为1∶5、1∶10、1∶50、1∶100）比值时，转染AdSVV的DC与未转染的DC比较，具有更强刺激同种异体