用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒t细胞抗淋巴瘤免疫效应

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1、用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T细胞抗淋巴瘤免疫效应作者：朱雄鹏，陈志哲，胡建达，李纯团，杨婷，许贞书【摘要】　　本研究探讨转染survivin(SVV)基因的树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗淋巴瘤的免疫效应。对人外周血DC进行诱导培养，以AdSVV转染DC，用LR）测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，以ELISA法检测上清中的细胞因子IL12含量。结果表明：在MLR中，刺激应答比（S/R）为1∶5、1∶10、1∶50和1∶100时，转染AdSVV的DC有较强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力；转染AdSVV的DC组所诱发的CTL

2、活性明显高于对照DC组；转染病毒后第2天，转染AdSVV的DC组的IL12分泌水平高于对照DC组。结论：含存活蛋白基因的DC能够在体外诱导特异性CTL效应，对CA46细胞有明显的杀伤作用。【关键词】survivin基因树突状细胞CA46细胞系淋巴瘤细胞毒性T细胞免疫治疗　　InductionofAntilymphomaCytotoxicTCellEffectbyDendriticCellsTransfectedmunologicaleffectsofmodifieddendriticcells(DCs)ininducingcytotoxicTcells(CTLs

3、)effectagainstlymphomacells.TheDCshumanperipheralbloodandtransfectedinethecytotoxicityofCTLs,themixedlymphocytereaction(MLR)easuretheabilitytoproleferateallolymphocytebyDCs,ELISAedbyLRassay,DCstransfectedphocytesreactionattheratiosof1∶5,1∶10,1∶50and1∶100.DCstransfecteduchhigheractivity

4、ofCTLtoCA46cellsthancontrolDCs.ThelevelsofIL12ofsupernatantscontainingDCstransfectedphomacells.Keyphoma;cytotoxicTcell;immunotherapy树突状细胞(dendriticcell,DC)作为机体内功能最强的专职抗原呈递细胞(APC)，在激活T细胞介导的免疫反应中起关键性作用，而survivin（存活蛋白，SVV）基因是肿瘤组织较为特异的基因，其编码的蛋白survivin成为肿瘤较理想的靶抗原之一。因此，我们以重组腺病毒介导SVV基因修饰DC，观

5、察诱导产生的特异性抗淋巴瘤免疫效应，为以DC为基础肿瘤免疫治疗提供实验依据。材料和方法材料表达survivin蛋白的重组腺病毒（AdSVV）由本所构建、包装［1］，滴度为：AdSVV2.65×109pfu/ml；恶性淋巴瘤细胞株CA46为本室保存株。总蛋白裂解酶、蛋白酶抑制剂为美国Pierce公司产品；兔抗人survivin多克隆抗体为北京中杉生物技术公司产品；辣根标记山羊抗兔IgG、OI为100加入重组腺病毒，分为3组：转染AdSVV的DC组(AdSVVDC)、空载体转染DC组（AdCMVDC）和未转染DC组（NDC），并补充生长因子GMCSF、I

6、L4（终浓度均为1000U/ml）。于37℃5%CO2，培养箱继续培养48小时(第9天)收集细胞。Survivin蛋白表达的LR)测定取培养第9天的AdSVVDC和NDC，分别加入丝裂霉素C，使其终浓度为50μg/ml，在37℃，5%CO2的培养箱中培养45分钟，作为刺激细胞。分别以2×104/孔、1×104/孔、2×103/孔、1×103/孔将DC加入96孔板中，以T淋巴细胞供者自身的PBMC为对照组，每组设3个复孔。每孔均加入1×105的T淋巴细胞，刺激反应细胞之比（S/R）分别为1∶5，1∶10，1∶50，和1∶100，终体积200μl，于37℃，5%C

7、O2的培养箱中培养96小时。终止培养前4小时加入MTT20μl（5mg/ml），培养终止后加DMSO200μl，充分混匀后静置。选择波长为570nm处测OD570值。计算刺激指数（SI），结果以3孔的均值表示。刺激指数（SI）=实验孔OD均值/对照孔OD均值CTL细胞体外杀伤活性的检测效应细胞的制备取培养第9天的AdSVVDC组细胞和NDC组细胞各5×105，作为刺激细胞，加入到24孔培养板中，按5×106/孔加入经T细胞尼龙毛柱分离的T淋巴细胞（反应细胞）；同时以不与DC共孵育的自体淋巴细胞为对照，每组设3个复孔。加入IL2（500U/ml