乳腺癌ba46基因转染树突状细胞诱导特异细胞免疫

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1、乳腺癌BA46基因转染树突状细胞诱导特异细胞免疫【摘要】目的探讨以腺相关病毒为载体，乳腺癌抗原BA46基因转染树突状细胞（DCs）诱导特异细胞免疫的可行性。方法取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞（DCs前体细胞），以AIMV培养基于6孔板培养，贴壁5h，轻轻洗去悬浮细胞，取贴壁细胞，将细胞分为基因转染组及对照组，基因转染组感染携带BA46基因的重组腺相关病毒rAAV/BA46/Neo，对照组以293细胞裂解物冲击，两组细胞均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）、白细胞介素4（IL4）、肿瘤坏死因子α

2、(TNFα)诱导DC前体细胞成熟。第7天，收集细胞(DCs)，显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析DCs的表面标志CD80、CD86、CD40、CD83、HLADR的表达情况；另取该DC与T细胞按比例混合，含5%人血清蛋白的AIMV为培养基，同时加入IL2与GMCSF，共育7天，诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，用3HTdR掺入法检测转染BA46制备的DC刺激自体淋巴细胞增殖能力；取BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T为靶细胞，采用51Cr释放法测量杀伤效率，同时以流式细胞仪分析CTL细胞中IFNα和IL4的表达情况。结果BA4

3、6基因转染制备的DCs形态正常，表面标志CD80、CD86、CD40、CD83、HLADR均表达良好，具备较强的刺激淋巴细胞增殖的能力，且能诱导抗原特异性和MHC限制性的细胞免疫。结论BA46基因转染法成功制备DCs，并诱导特异的细胞免疫，为乳腺癌的DCs基因疗法打下基础。【关键词】树突状细胞BA46腺相关病毒乳腺癌　　0引言　　树突状细胞(DCs)是人体内功能最强大的抗原递呈细胞，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用，采用体外培养DCs，特异肿瘤抗原刺激制备DCs疫苗，免疫机体从而激发特异的细胞免疫有望成为一种理想的肿瘤治疗手段[1,2]。

4、此疗法的关键是获得特异的肿瘤抗原，并将该抗原转导DCs。乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，BA46几乎在所有的乳腺癌细胞高表达，而在乳腺以外的正常组织内不表达[36]，以其抗原肽免疫转基因鼠，可在其身上诱导出特异的细胞免疫[7]。因此它可做为乳腺癌DCs治疗非常理想的肿瘤抗原。本研究以腺相关病毒（AAV）为载体，成功制备高滴度的携带BA46基因的重组腺相关病毒（rAAV/BA46/Neo病毒）[8]。在此基础上，取人外周血单个核细胞（DCs前体细胞），体外培养，以rAAV/BA46/Neo病毒转染DCs前体细胞，GMCSF、IL4和TNF

5、α诱导DCs成熟，加入T细胞，GMCSF和IL2诱导，最终获得针对BA46的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，并检测该CTL对BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T的杀伤效果及CTL细胞中IFNγ和IL4的表达情况，探讨此基因转染法制备DCs，诱导特异细胞免疫的可行性。　　1材料与方法　　１．１病毒重组乳腺癌BA46基因腺相关病毒（rAAV/BA46/Neo）由作者于阿肯色大学医学院基因治疗中心制备，病毒滴度为1×1010个病毒颗粒/ml[8]。　　１．２主要试剂AIMV培养基购自GIBCOinvitrogen公司；Ficoll淋巴细胞

6、分离液购自Sigma公司；AIMV(R)无血清淋巴细胞培养基购自GIBCOInvitrogen公司；GMCSF购自Immunex公司；IL4购自RDSYSTEMS公司；FITC标记的AntiCD40抗体购自Immunotech公司；FITC标记的antiCD80、antiCD83、antiHLADR、antiIFNγ和PE标记的antiIL4均购自BectonDickinson公司；FITC标记的antiCD86购自Pharmingen公司。　　１．３主要仪器流式细胞仪为美国BectonDickinson公司产品；液

7、闪计数仪为美国Backman公司产品。　　1．4人外周血DC的培养取健康人外周血50ml，Ficoll分离，收集淋巴细胞，以AIMV为培养基，调节细胞浓度为109/ml，培养于6孔板，每孔2.5ml，在37℃、5%CO2孵箱中培养，贴壁5h，轻轻洗去悬浮的淋巴细胞，取贴壁的单个核细胞，每孔加2.5ml含GMCSF（终浓度为800U/ml）的AIMV培养基，将细胞分为基因转染组和对照组(未感染病毒组)，基因转染组每孔加rAAV/BA46/Neo病毒液0.5ml，感染5h后换液为每孔3ml含GMCSF（终浓度为800U/ml）的AIMV培

8、养基，对照组每孔只加293细胞冻融液0.5ml。两组细胞均于第2天半量换液，于第3天全量换液为含GMCSF（终浓度分别为800U/ml）和IL4（