tlr4基因转染树突状细胞对支气管哮喘免疫调节作用

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1、鼍’{独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日铆即月弋日‘^·’一、’，r一膏，2007年1O月◆够、0、一't‘ClassifiedIndex：UDC：Ph·D·DissertationImmuneregulationofDendriticCellTransfectedbyGeneTL

2、R4forBronchialAsthmaBySuiJianMajor：AgricultureProductsProcessandStorage‘一●EngineeringSupervisor：Prof．XUHuaxiJiangsuUniversityOctober,2007IfX^，J、摘要背景支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，属于超敏反应性质，多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子与其发生发展有关，其中辅助T细胞亚群(Thl／Th2)的失衡、Th2细胞数量增加、功能活化起着关键作用。树突状细胞是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞(APC)，系已知唯一能

3、活化初始T细胞的APC，是识别内外源性抗原、调节天然免疫和获得性免疫的关键因素。已知分布于气道的DC是呼吸道免疫防御的前哨细胞，在通过胞饮、吞噬或受体介导的内吞三种方式摄取吸入性抗原后逐渐成熟，趋化因子、共刺激分子和MHCII类分子表达增加，而FcYRII、FcYRI和Fc￡RI等表达减少，并于24小时内从气道迁移至纵隔淋巴结产生初级免疫应答，促使初始Th细胞(ThO)向Thl或Th2分化。Tho的活化需DC参与的抗原识别信号和协同刺激信号，其分化方向受控于抗原刺激后DC分泌的细胞因子，IL一12和IFN—Y是诱导ThO向Thl分化的重要细胞因子。

4、许多试验显示DC的免疫调节作用与其细胞膜表面TLR的表达有关，一般认为相应PAMP通过TLR4激活DC主要引起IL-12p70、IFN—Y介导蛋白(IP一10)等细胞因子大量增加。鉴于树突状细胞TLR4对于T细胞分化的调节作用，若将TLR4基因通过腺病毒载体导入抗原(如LPS)激发的DC，可促使DC分泌较多的IFN—Y等，上调ThO表达的IL一12RB2和TLR4，从而利于ThO向Thl分化。目的将转染了TLR4基因和LPS致敏的DC输入OVA诱导的过敏性哮喘模型小鼠体内，以促进Thl的分化，逆转过敏性哮喘的Th亚群失衡，从而江苏大学博士学位论文：

5、TLR4基因转染树突状细胞对支气管哮喘的免疫调节作用通过TLR4基因转移DC干预的免疫调节方式探讨哮喘基因治疗的新方法。方法1．利用RT-PCR方法，从Balb／c小鼠脾组织细胞mRNA中扩增TLR4基因全长eDNA，并将其连接到pcDNA3．1(+)载体上，进行测序和核酸分析。2．采用AdMax包装系统，将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞，利用Cre／loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。RT—PCR方法检测AdV-TLR4mRNA在传代DC中的表达、WesternBlot方法检测AdV—T

6、LR4蛋白的表达。3．RT-PCR方法检测AdV—TLR4转染的DCIL一12mRNA、IL一4mRNA和IF卜YmRNA表达的变化；ELISA方法检测AdV-TLR4转染的DC培养上清IL-12、IL-4和IFN-Y的表达水平；流式细胞仪分析AdV-TLR4转染的DC表面免疫特性标志蛋白Ia、CD40、CDSO和CD86的改变。4．0．1％OVAAl(OH)。溶液皮下注射、1％0VA的生理盐水溶液雾化吸入的方法制备小鼠哮喘模型；福尔马林组织固定、包埋、切片，HE染色和AB／PAS复染进行小鼠肺组织学形态观察，Gimsa—Wright染色观察BAL

7、F中Eos；骨髓细胞分离，红细胞裂解液处理，GM—CSF和IL一4诱导、RMPI1640完全培养基培养的方式获取DC，行哮喘小鼠DCTLR4mRNA和TLR4蛋白表达检测；ELISA方法检测小鼠脾细胞IL-4、IL-5、IFN_Y和血浆IgE含量、人血浆IL一4和IgE含量、BALF中IL一4和IgE含量；流式细胞仪方法检测脾细胞CD4+CD25+细胞百分比。齄甲耋口木1．扩增得到的小鼠TLR4基因eDNA全长2508bp，编码536个氨基酸，blast结果分析表明，该cDNA与Genbank中发表的序列(NM021297)具有Ⅱ。’摘要100％的

8、同源性。2．重组质粒pDC316--mTLR4的PCR及酶切鉴定表明，TLR4基因被定向插入；与pBHGF35骨架质粒共转