树突状细胞负载肺癌细胞抗原的方法研究

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1、树突状细胞负载肺癌细胞抗原的方法研究：王勇,张科,童继春,钱科卿,史央,陆俊欢,时宏珍【摘要】目的:建立自体热休克凋亡肺癌细胞抗原制备、树突状细胞（DC）体外诱导、以及抗原负载方法,为制备DC肿瘤疫苗提供技术基础。方法:采用酶消化法从手术切除的肺癌新鲜组织获得单细胞悬液,热休克后用白桦脂酸诱导其凋亡制备成细胞抗原;采用血细胞分离机采集外周血单个核细胞（PBMC）,贴壁法获得单核细胞,经GMCSF与IL4体外诱导成未成熟树突状细胞（imDC）;负载细胞抗原后制备成DC肿瘤疫苗,并对DC疫苗的形态、数量及表

2、型特征进行分析。结果:（1）肿瘤细胞抗原得率:（13.68±1.30）×106/g组织;平均凋亡率:（93.79±2.31）%;（2）imDC平均得率为（9.37±0.83）×106/（118.77±12.56）×106个PBMC,活率>95%;imDC表型分析:CD11c+CD14-、CD11c+HLADR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表达率分别为（87.45±3.42）%、（87.16±1.08）%、（2.80±1.52）%、（5.64±1.56）%、

3、（5.11±1.09）%;（3）DC疫苗平均得率为（5.75±0.69）×106/（9.37±0.83）×106个imDC,活率>95%,DC疫苗表型:CD11c+CD14-、CD11c+HLADR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表达率分别为（92.73±1.21）%、（89.35±2.31）%、（86.80±1.23）%、（69.53±7.21）%、（94.92±1.48）%。结论:该方法稳定、安全、可靠,可制备出具有成熟DC表型的肿瘤疫苗。【关键词】树突

4、状细胞;肺癌;疫苗树突状细胞（dendriticcell,DC）是至今发现的体内功能最强的抗原提呈细胞（antigenpresentingcells,APC）,具有激活静息性T淋巴细胞成为抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicTlymphocytes,CTL）的特殊功能,在机体抵抗肿瘤发生、发展中发挥关键作用［1,2］。同时DC还能与其他免疫细胞如自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK)、NKT细胞发生相互作用,分泌细胞因子增强机体的天然免疫功能［3,4］。近年来,DC疫苗在肿瘤临

5、床综合治疗中的作用与应用已引起广泛重视,成为肿瘤生物治疗的重要代表。以患者自体肿瘤细胞作为抗原负载自体DC而制备DC疫苗在国外已有研究［5,6］,但国内尚未见相关报道。本研究将探讨并建立利用肺癌细胞抗原负载自体DC的实验方法,为今后肺癌DC疫苗的研制提供依据,为肺癌的生物治疗提供手段。1材料和方法1.1材料RPMI1640培养基购自JRH公司。人重组GMCSF与IL4购自RD公司。AB血清购自常州市中心血站。淋巴细胞分离液购自上海恒信化学试剂有限公司。PE标记的小鼠抗人CD80、PE标记的小鼠抗人CD8

6、3、PE标记的小鼠抗人CD86、PerCP标记的小鼠抗人HLADR、APC标记的小鼠抗人CD11c、PE标记的小鼠抗人CD14单克隆抗体（mAb）购自BD公司。内毒素检测试剂盒购自湛江安度斯生物有限公司。1.2方法1.2.1肺癌单细胞悬液制备于手术过程中,无菌采集新鲜肺癌肿瘤组织3～5g左右,迅速放入装有无菌组织保存液的运输瓶中,用封口膜封口,置于4℃冰上运输至实验室。组织称重后,用含双抗的生理盐水洗涤数次,剔除结缔组织、脂肪及坏死组织。将肺癌组织剪碎至1～2mm3大小,加入胶原酶,37℃培养箱作用30～

7、50min,将消化后的细胞悬液过筛（200目）,收集单细胞悬液。苔盼蓝染色法对细胞进行计数,并计算活细胞比例。1.2.2凋亡细胞抗原制备用RPMI1640培养液调整细胞密度至1×109/L,将细胞置于40℃、50mL/LCO2培养箱中3h,取出细胞培养瓶,加入白桦酯酸至终浓度为10mg/L,将细胞培养瓶移至37℃、50mL/LCO2培养箱继续培养诱导细胞凋亡。收获凋亡细胞,加入无菌PBS洗涤4次,获得凋亡肿瘤细胞抗原［7］。1.2.3抗原质量检测用苔盼蓝染色法进行计数与活细胞鉴别。用FITCAnnexin

8、V和PI标记细胞,进行流式检测［8］,计算细胞凋亡率。软琼脂克隆法［9］检测细胞抗原体外成瘤能力。内毒素检测按《中华人民共和国药典》2005版第3部规定的方法进行。1.2.4制备DC（1）PBMC采集:采用血细胞分离机进行PBMC的采集。按仪器说明书和相关临床操作规程进行。将浓缩白细胞用生理盐水洗涤1次获得新鲜的PBMC。（2）DC诱导:用RPMI1640培养液重悬新鲜制备的PBMC后铺于6孔细胞培养板中,放置