乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒负载的树突状细胞抗原提呈能力的研究

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2、本论文由本人独立撰写，文责自负。．碱蚴：警中文摘要乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒负载的树突状细胞抗原提呈能力的研究摘要目的：树突状细胞(dendriticcells，DC)作为目前发现的抗原提呈能力最强的专职抗原提呈细胞，控制着免疫应答的性质、强度和免疫记忆性。随着DC体外培养技术的建立，已有多项研究表明，体外培养的不成熟DC可高效摄取病毒样颗粒(virus—likeparticles，VLPs)，不仅可诱导体液免疫的发生，而且可通过交叉抗原提呈途径，激发细胞免疫反应。在此过程中，VLPs除作为抗原表达载体为DC提供了特异性抗原外，还可刺激DC成熟，

3、诱导DC的MHC．I和II类分子及～些黏附分子的表达。因此，用VLPs负载DC，构建DC疫苗，为肿瘤和胞内感染病原疫苗的研制开辟了新的途径。乙肝病毒核心抗原(HepatitisBcore，HBc)是乙肝病毒的重要结构蛋白，在细菌、酵母菌及哺乳动物细胞内均能高效表达、自动装配成球形颗粒，并可插入外源短肽，同时保持外源肽或表位正确构象，有较强免疫原性。因此，用HBc—VLPs负载DC，可能是DC疫苗研究的较好模型。随人类基因组计划实施和推进，生命科学研究进入后基因组时代，新的学科．蛋白质组学(Proteomics)诞生。蛋白质组学可刚来研究细胞内所有

4、蛋白质及其动态变化规律，能从更深一层次认识生命活动的规律。基于上述原因，在本研究中，我们在原核系统表达了乙肝核心蛋白，以其组装成的乙肝核心蛋白病毒样颗粒中文摘要(IIBc—VLPs)为模型，首次采用能获得高通量信息的蛋白质组学技术研究DC摄取ttBc—VI。Ps后细胞整体蛋白谱的改变，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix—assistedlaserdesorptionionizationtime—of-flightmassspectrometry，MALDI—TOF／MS)鉴定得到了有意义的蛋白质，为研究DC细胞活化和DC疫苗的免疫

5、机制提供了新的线索和思路。方法：(1)乙肝核心蛋白病毒样颗粒的制备：扩增pET28a—HBc的工程菌，IPTG诱导蛋白表达，包涵体形式表达的HBc蛋白的变性、Ni—NTA亲和层析纯化和复性。(2)HBc．VLPs的签定：通过SDS．PAGE电泳、蛋白免疫印迹实验检测HBc蛋白的表达和免疫原性，透射电镜观察HBc蛋白VLPs的形成。(3)小鼠骨髓源树突状细胞的体外培养：树突状细胞由小鼠骨髓获得经细胞因子rmIL．4和rmGM—CSF诱导分化成为未成熟BMDC。(4)BMDC对HBc—VLPs的吞噬：激光共聚焦显微镜观察不同时间点小鼠BMDC对HBc

6、．VLPs的吞噬。(5)流式细胞仪分析BMDC表面分子标记：FITC标记的抗小鼠CDIlc抗体SDFITC标记的抗小鼠CD86、CD80和MI-IC—11分子抗体表面染色后，流式细胞仪检测。(6)细胞因子的mRNA水平测定：常规方法抽提不同处理组BMDC细胞的总I洲A，j智-mRNA反转录为cDNA片段。用合成的细胞因子(IFN一弘TL—12)和内参照(p—actin)lK3引物，扩增cDNA片段并进行琼脂糖凝胶电泳检测。(7)BMDC摄取IVIBc—VLPs前后细胞总体蛋白表达的差异及差异蛋白的质谱分析：①摄取HBc．VLPs前后BMDC细胞总

7、蛋白的二维电泳：I蛋白样品的准备：提取细胞蛋白经Clean—Up处理后，BCA法测定蛋白样品浓度。II二维电泳：一向：等电聚焦，每根IPG上样150“g，经30伏持中文摘要续低电压水化、200伏，l小时除盐后，梯度升压、稳压至8000伏，持续6—8小时，保证总量为50000伏特小时；二向：聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)：灌制板胶、将胶条平衡处理后转移至胶板、20mA／gel垂直电泳5—6小时。III石N酸银染色：固定、敏化、漂洗、硝酸银染色、漂沈、显色、终止、漂沈、1％乙酸中保存。②蛋白点分析与选取：凝胶通过ChemiIamgervM55

8、00成像系统获得数字化的图像。使用计算机应用图像软件IamgerMasterlM5．0对图像进行分析，选取明显差异的蛋白点(3倍或以上差