慢病毒载体介导gfp标记大鼠骨髓间充质干细胞

《慢病毒载体介导gfp标记大鼠骨髓间充质干细胞》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、慢病毒载体介导GFP标记大鼠骨髓间充质干细胞：魏峰，马爱群，王亭忠，张静【摘要】目的探究慢病毒载体介导绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)标记大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的理想条件,以获得稳定高表达GFP的MSCs亚群。方法慢病毒载体介导GFP以25、50、100、200和400的感染复数(multiplicityofinfection,MOI)分别作用12h和24h感染MSCs，倒置荧光显微镜及流式细胞术检测各组的感染效率和荧

2、光强度，MTT法评价感染对MSCs增殖的影响，从而确定理想的感染条件。平皿克隆套环法挑选理想条件下感染的MSCs单克隆。结果MOI为100、200和400作用24h时，感染效率较高，分别为88.94%、99.65%、99.42%;MOI为100和200时，感染对MSCs增殖无影响，MOI为400时，感染的MSCs增殖减慢。挑选MOI为200、作用24h感染组的单克隆细胞，其1月时感染效率为99.95%，且荧光均一、强度很强。结论MOI为200作用24h是慢病毒载体介导GFP标记MSCs的理想条件;通过细胞单

3、克隆技术可获得稳定高表达GFP的MSCs亚群。【关键词】间充质干细胞;慢病毒载体;绿色荧光蛋白;单克隆　　ABSTRACT:ObjectiveTodeterminetheoptimalconditionforlabelingratbonemarroesenchymalstemcells(MSCs)icroscopyandfloetry.TheeffectofinfectionatdifferentMOIonproliferationofMSCsentionedabove,inetheoptimalcondi

4、tionforinfection.ThensinglecellclonesofMSCslabeledalcondition.ConclusionInfectionfor24hatMOI200isoptimalforlabelingratbonemarroesenchymalstemcell;lentiviralvector;greenfluorescentprotein;monoclone　骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是一种于中胚层具有多向分化潜能的成体干细胞，在一

5、定条件下可分化为软骨细胞[1]、神经细胞[2]、胰岛细胞[3]、肺上皮细胞[4]等各胚层的组织细胞。目前已成为再生医学研究中的热点细胞。然而稳定高效标记MSCs是进行体内示踪研究亟待解决的关键问题。慢病毒载体介导的转基因具有效率高、外源基因长期稳定表达、安全性好[5]等优点。因此，我们拟通过慢病毒载体介导绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)来标记大鼠骨髓MSCs，探讨其标记的理想条件，从而建立稳定高表达GFP的MSCs亚群，为体内深入研究MSCs的分化行为奠定基础。　　1材

6、料与方法　　1.1材料低糖DMEM(DulbeccosmodifiedEaglesmedium)和胎牛血清购自Gibco公司;Percolls细胞分离液(1.131g/mL)购自Pharmacia公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司;携带GFP的慢病毒载体pGCFUGFPLV购自上海吉凯基因化学有限公司。克隆环为Corning公司生产;酶标仪为美国BioTek公司生产;流式细胞仪为美国BD公司生产。　　1.2方法　　1.2.1大鼠骨髓MSCs的培养及表面标志

7、鉴定参照文献方法[6]，主要采用Percolls密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，流式细胞术检测2代MSCs表面CD34、CD45、CD54、CD90的表达。　　1.2.2慢病毒载体介导GFP感染MSCs将3代MSCs制成单细胞悬液，连续计数3次，取平均值为最终细胞密度。将细胞稀释为1×104个/mL，接种于96孔板中(2个时间点，5个MOI梯度，每个梯度3个复孔，共30个孔)，每孔200μL，培养16h后，各孔以25、50、100、200、400的MOI加入携带GFP的慢病毒载体，分别

8、感染12h和24h，PBS冲洗5遍，换为不含病毒载体的完全培养基继续培养，以后每天观察感染结果。　　1.2.3流式细胞仪检测GFP的感染效率将MOI为100、200、400感染24h的MSCs制成单细胞悬液，20g/L的多聚甲醛固定10min，流式细胞仪测定GFP的表达率及平均荧光强度，未感染的MSCs作为对照。　　1.2.4MTT法检测感染后的MSCs增殖情况MOI为100、200、400感染24h的MSCs和