wistar大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和标记

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1、Wistar大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和标记赵科研柳克祥侯明晓孙江滨吴慧颖李博【摘要】　　目的建立SCs）分离、培养的方法，并进行鉴定、标记。方法采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠的MSCs。采用相差显微镜观察MSCs的形态学特征；流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表达率；电镜检查第3代MSCs超微结构。DAPI标记MSCs为下一步进行体内细胞移植示踪。结果原代培养的MSCs于6～8h后贴壁，6d左右形成集落，14d左右可达到80%～90%融合。第3代细胞表面标记物

2、CD29，CD44，CD34和CD45的阳性率分别为98.6%，78.2%，0.0%，0.3%。超微结构清晰，可见细胞器，如线粒体、粗面内质网和高尔基复合体，细胞核呈圆形或不规则，可见较多微绒毛。DAPI可良好标记MSCs细胞核，呈蓝色荧光。结论采用全骨髓贴壁培养的方法能够成功分离和培养大鼠的MSCs，在第3代可获得高纯度MSCs。DAPI可以作为一种示踪剂标记MSCs。【关键词】细胞培养；间充质干细胞；种子细胞；示踪剂【Abstract】ObjectiveToestablishamethodforisolat

3、ionandcultureofbonemarroesenchymalstemcells(MSCs)fromethodsMSCsthebonemarroethod.ThemorphologyofMSCsicroscope.TheexpressionofCD29,CD44,CD34andCD45ofthethirdgenerationcellsetry.Electronmicroscopicfeaturesaryculture,MSCsadheredtoplasticsurfaceoftheculturedish.

4、　About6dlater,thecellsproliferatedincolonies.PrimaryMSCsreached80%～90%ofconfluencein14dapproximately.ThepositiveratesofCD29,CD44,CD34,andCD45inMSCsatthirdgenerationicroscopeMSCshadplentifulcytoplasmitochondriaroughendoplasmicreticulaandGolgiplexes.Theirnucle

5、iicrovillionthesurface.AlloftheMSCsafterlabelingbyDAPIshoalstemcellscanbesuccessfullyisolatedandcultivatedbyadherentmethod.AndhigherpurityMSCscanbepickedupaftercultureexpansionatP3.DAPIcanbeaneffectivetraceragenttolabelMSCs.【Keyalstemcells;Seedcells;Tracerag

6、ent　　骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞，可以向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、干细胞、肌细胞、神经细胞以及心肌细胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于体外扩增，因其来源充足、取材方便，体外增殖能力相对较强，而且在异体移植中排斥反应小，被认为是组织工程和基因工程的理想种子细胞，为心血管疾病、神经疾病和骨关节疾病的治疗提供了一条全新的治疗方案。本文在总结贴壁分离法培养MSCs的基础上，优化MSCs纯化、鉴定、标记的方法，以获得稳定的

7、培养体系，为应用组织工程技术提供大量的种子细胞。　　1材料与方法　　1.1动物　　清洁级雄性EM培养基(Gibco公司),特级胎牛血清(Gibco公司),胰酶(Sigma公司)，亚美尼亚仓鼠抗大鼠CD29AlexaFluor(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45过氧化物酶（FITC）(Biolegend公司),小鼠抗大鼠CD44PE(SantaCruz公司),小鼠抗大鼠CD34FITC(SantaCruz公司),46二脒基2苯基吲哚（DAPI）储存液(Sigma公司)。　　1.3分离和培养

8、　　EM冲洗骨髓腔，取混悬液，1000r/min离心10min，弃上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混悬，将获得的细胞接种在100ml培养瓶中，5%CO2,37℃下培养24～48h，换液，去除未贴壁细胞，2～3d更换一次培养基，光镜观察细胞融合情况，细胞80%融合后传代，0.25%胰酶消化，用血球计数仪计数细胞、传代，培养3～5代细胞。　　1.4透射电镜样品制备　　将培养3代10c