慢病毒介导RNAi干扰βcatenin对小鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

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1、研究生个人简介付成娟2010—2013年就读于徐州医学院血液病学专业型硕士研究生学位，通过国家英语六级考试，就读期间修满学分26．5分，完成12个月临床培训，顺利完成学位课题研究及毕业论文写作，通过论文盲审。研究方向：移植免疫学研究课题名称：慢病毒介导RNAi干扰B-catenin对小鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的影响完成文章：中文核心l篇。目录缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一2Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘4第一

2、部分慢病毒颗粒的制备与高效[3-catenin／shRNA干扰序列的筛选⋯⋯⋯⋯。8第二部分13-catenin／shRNA干扰序列对MSCs细胞生物学行为影响的探讨⋯⋯28讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43攻读硕士学位期间发表学术论文题目⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52临床培训小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55论文声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56论文审阅认定书⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57徐州医学院硕士学位论文缩略词BSADEPCDMSOdsRNAFBSFCMGFPm剐NAODPBSPCRRNAi英文全称缩略词表AbbreviationBovineserumalbuminDiethylpyrocarbonate中文全称牛血清白蛋白焦碳酸二乙酯Dimethylsulphoxide二甲基亚砜Double．strandedRNAF

4、etalbovineserumFlowcytometryGreenfluorescentproteinMessengerRNAOpticaldensityPhosphatebufferedsalinePolymerasechainreactionRNAinterference双链RNA胎牛血清流式细胞术绿色荧光蛋白信使RNA吸光度磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应RNA干扰RT-PCRReversetranscriptasepolymerasechain逆转录-多聚酶链反应shRNAsiRNAreactionShorthairpinRNASmallinterferenceRNA短

5、发卡状RNA小干扰RNA徐州医学院硕士学位论文慢病毒介导RNAi干扰13-catenin对小鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的影响中文摘要目的构建针对小鼠I％catenin的短发卡RNA(shorthairpinRNA，shRNA)的慢病毒表达载体并筛选出高效的13-catenin／shRNA干扰序列，探讨RNAi(RNAinterference，RNAi)沉默13-catenin分子对骨髓间充质干细胞(MSCs)生物学行为的影响。方法①设计三对针对13-cateninmRNA不同位点的shRNA编码序列，分别连接到慢病毒载体质粒PLB中，构建PLB—D-catenin／sh

6、RNAl，PLB-p-catenin／shRNA2，PLB．B．catenin／shRNA3；通过PCR及测序进行鉴定；②分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞，包装慢病毒颗粒，并依据绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)表达水平检测病毒滴度；③慢病毒颗粒感染MSCs细胞后，利用流式细胞术分选GFP阳性细胞，实时荧光定量RT-PCR和Westernblot技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测[3-catenin的表达，筛选出沉默效率最高的干扰序列；④实验分三组：不加任何处理的MSCs细胞、空载体组处理的MSCs细胞、13-cat

7、enin／shRNA2组(p．catenin沉默率最高的MSCs细胞)。通过CCK．8法检测各组细胞的增殖变化；经血清饥饿法诱导72h后，采用AnnexinV-APC／7．AAD双染色法检测各组细胞的凋亡情况；细胞划痕和Transwell实验检测细胞的修复和迁移能力。结果①经PCR及测序结果证实，成功构建PLB．B—catenin／shRNA重组慢病毒质粒，重组慢病毒滴度达108IU／mL；②重组慢病毒颗粒感染MSCs细胞后，特异性干扰组(PLB．p．catenin／shRNA1，2)13-cateninmRNA和蛋白表达量均