腺病毒载体介导egfp转染大鼠骨髓间质干细胞研究

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1、腺病毒载体介导EGFP转染大鼠骨髓间质干细胞研究：王兴忠，孟静，陈丽萍，吕汉琰,朱伟，许文荣【摘要】目的：探讨腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的生物学特性。方法：骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓MSCs并采用流式细胞术进行鉴定。利用脂质体法通过腺病毒转染获得EGFP修饰的大鼠骨髓MSCs。结果：成功分离得到大鼠MSCs，腺病毒转染后大鼠骨髓MSCs过表达绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因，且转染后MSCs具有成骨分化潜能。结论：通过腺病毒转染能获得EGFP标记的大

2、鼠MSCs，为MSCs组织工程和基因治疗研究提供了依据。【关键词】间质干细胞;腺病毒载体;基因治疗;转染　　[Abstract]Objective:Toinvestigatethebiologicalcharacteristicsofratbonemarroesenchymalstemcells(MSCs)transfectedgreenfluorescentprotein(GFP)genebyadenovirusvector.Methods:Ratbonemarroethod.Floetricanalysesine2000.Re

3、sults:Ratbonemarroarroaypotentiallybeusedasatargetfortissueengineeringandgenetherapy.　　[Keyesenchymalstemcells;adenovirusvector;genetherapy;transfection　　MSCs是一类存在于骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝、脐血、外周血等多种组织的多能干细胞，其中骨髓、脐带是最常用的MSCs体外分离培养的组织[1,2]。MSCs具有体外高度扩增、多向分化、易于外源基因的转染和表达等特性[3-6]，并且

4、转入外源性基因能稳定、有效、持久地表达，因而作为理想的载体细胞在基因治疗领域上具有广泛的应用前景[7]。然而选择一个合适的基因转移方法是MSC转基因治疗的关键。目前病毒介导的基因转染在基因功能研究和基因治疗中占有重要地位，尤其是腺病毒载体具有感染效率高、安全性好、理化性质较稳定、外源基因的容纳量大等多种优点，是基因治疗中运用最广的病毒载体之一，因此，本研究建立腺病毒载体转染大鼠骨髓MSCs方法，观察腺病毒转染后MSCs的生物学特性，为基于骨髓MSCs的转基因治疗提供了依据。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1试剂穿梭质粒p

5、AdtrackCMV[整合有绿色荧光蛋白(EGFP)基因]、腺病毒骨架质粒pAdEasy1、DH5α及大肠埃希菌BJ5183(本室保存)，293A细胞(中科院上海细胞所)、DMEM培养基(Gibco)、RTPCR成套试剂盒(Promega公司)，各种限制性内切酶PacⅠ，XhoⅠ，HindⅢ及T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶等(Takara公司)，质粒提取试剂盒(Axygen公司)，Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen公司)，引物由上海生物工程有限公司合成。　　1.1.2仪器二氧化碳培养箱(美

6、国FORMA公司)，S,美国BioRed公司)，倒置生物显微镜(TE300，Nikon)，细胞培养瓶、细胞培养皿(Nunclon,Damerk)。　　1.2方法　　1.2.1MSCs的分离和培养无菌取出SD大鼠股骨，用LDMEM冲洗骨髓腔，得到细胞悬液，转入离心管用1.077g/mlFicoll泛影葡胺细胞分离液进行密度梯度离心，取单个核细胞层洗涤，用含10%胎牛血清和LDMEM调整洗涤后细胞终浓度，接种于一次性塑料培养瓶中，37℃，5%CO2孵箱培养。3d后去除未贴壁细胞，3～4d换液1次，待细胞80%融合时，用含0.1m

7、mol/LEDTANa2的2.5g/L胰酶室温消化，适量小牛血清终止消化，吸管轻轻吹打，转入离心管，800～1000r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀按1∶3比例传代。　　1.2.2MSCs表面标志的检测取第3代大鼠MSCs与FITC或PE标记的抗鼠CD29，CD34，CD38，CD71，CD95，CD44，CD105，HLADR及HLAⅠ作用30min，经流式细胞仪检测。　　1.2.3腺病毒包装包装前1天接种293A细胞6×105个于10cm盘中培养过夜，第2天转染前换成无血清培养液，然后将经PacⅠ线性化的带有EG

8、FP的腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV与PacⅠ线性化的腺病毒骨架载体pAdEasy1各10μg用无血清培养液稀释至1.5ml，同时将Lipofectamine2000脂质体复合物稀释至1.5ml，室温静置5min后将脂质体复合物加至质粒复