慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究.doc

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1、慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究【摘要】目的：分离培养人骨髓来源间质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法：采取全骨髓贴壁培养法分离培养人骨髓MSCs。利用脂质体法进行慢病毒感染人骨髓MSCs。结果：分离培养出人骨髓来源的MSCs，并用携带绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。结论：获得人骨髓MSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰，为间质干细胞基因工程和组织工程研究奠定了基础。【关键词】间质干细胞;慢病毒;转染　　［Abstract］Objectiv

2、e:Toisolateandculturemesenchymalstemcells（MSCs）derivedfromhumanbonemarrowandtransfectthecellsbylentiviralvectors.Methods：ThetissueadherentculturemethodwasusedtoisolateMSCsfromhumanbonemarrow.TheMSCsweretransfectedbylentiviralvectorsusinglipofectamine2000.Results：Humanbo

3、nemarrowMSCsweresuccessfullyisolatedandefficientlytransfectedbyEGFP-expressinglentiviralvectors.Conclusion：HumanbonemarrowMSCshavebeentransfectedbylentivirus,whichwillplayaroleinresearchingonthefunctionofMSCsingeneandtissueengineering.　　［Keywords］mesenchymalstemcells；le

4、ntiviralvector;transfection　　间质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）存在于多种组织，主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝脏、脐血及外周血等，骨髓是最常用的MSCs体外分离培养的组织来源。MSCs增殖能力强，体内外均具有多向分化潜能，基因修饰后保持原有多潜能性的同时可持续稳定表达外源基因；体外转染和培养一段时间移植至体内仍可存活，并能够迁移至病变部位,因而其成为基因治疗研究领域令人关注的靶细胞［1］。因此，本研究从人骨髓组织中分离培养出MSCs并体外扩增用于慢病毒转染，为进一步利用MS

5、Cs进行基因治疗奠定基础。　　1材料与方法　　1.1标本和主要试剂　　成人骨髓（江苏大学附属医院），慢病毒三质粒系统FUGW，pCMVR-delta8.9和VSVG（上海医学遗传所惠赠），人胚肾293T（本实验室保存），胎牛血清和L-DMEM（Gibco公司），胰蛋白酶（Sigma公司），lipofectamine2000转染试剂盒(Invitrogen公司），Polybrene（Sigma公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（Toyobo公司），PCR试剂（Takara公司），质粒提取试剂盒（Ax

6、ygen公司），限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ（NEB公司）。引物设计采用primerpremier5.0软件，由上海生物工程有限公司合成。6　　1.2主要仪器　　二氧化碳培养箱（Forma公司），BeckmanSW28Rotor超速离心机（Beckman公司），PCR仪（ThermoHybaid公司），流式细胞仪(FACSCalibur,BD公司)，倒置式生物显微镜(TE300,Nikon公司)，细胞培养瓶和培养皿（Corning公司）。　　1.3方法　　1.3.1人骨髓MSCs的分离扩增根据本室建立的方法分离培养人骨髓MSCs

7、［2］。主要操作如下：新鲜分离的骨髓液5ml加入含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液中，用吸管吹打混匀后，800r/min离心10min去除含脂滴上清。细胞沉淀种在含10%胎牛血清的L-DMEM营养液中，37℃、5%CO2饱和湿度培养。5d后半量换液,第7～10天后见有较多贴壁细胞后全量换液，此后每3天换液1次。细胞80%左右融合时,用含0.1mmolEDTA-Na2的0.25%胰酶室温消化,细胞沉淀按1∶3比例传代。待其生长接近融合层时，即得到人骨髓来源的MSCs。　　1.3.2人骨髓MSCs表面标志检测取1×105第3代人骨髓MSCs与

8、FITC或PE标记的鼠抗人CD13，CD29，CD44，CD105，CD31，CD34，HLA-Ⅰ及HLA-DR在4℃作用30min后，经流式细胞仪检测。阴性对照为FITC结合的鼠IgG1和PE结合的鼠IgG1。　　1.