腺病毒载体介导SCL基因转染 Cajal间质细胞及其表达.doc

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1、腺病毒载体介导SCL基因转染Cajal间质细胞及其表达作者：张林童卫东刘宝华李春穴　【摘要】目的构建含有人干细胞白血病(stemcellleukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体，并观察其对Cajal间质细胞的转染及其介导的SCL基因的表达。为下一步在体转染Cajal间质细胞，观察其对Cajal间质细胞表型逆转的影响奠定基础。方法利用AdEasy系统、细菌内同源重组法快速构建重组腺病毒AdGFP/SCL。通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对培养的Cajal间质细胞的转染效率。通过RTPCR法分析转染Cajal间质细胞后SC

2、LmRNA的表达。结果酶切鉴定及PCR结果证明成功构建了含有人SCL基因的重组腺病毒，病毒滴度为1.6×1011pfu/ml；对Cajal间质细胞的转染率高达100%；RTPCR法检测转染Cajal间质细胞后SCLmRNA有表达。结论成功构建的含人SCL基因的重组腺病毒对Cajal间质细胞有很强的转染能力，可介导SCL基因在Cajal间质细胞中表达。【关键词】腺病毒载体；干细胞白血病基因；同源重组；转染；Cajal间质细胞【Abstract】ObjectiveToconstructrecombinantadenovirusvectorc

3、ontaininghumanstemcellleukemia(hSCL)genetoobserveitsabilityintransfectingCajalinterstitialcellsandmediatingSCLgeneexpression,whichmaylaybasisforfurtherinvivotransfectionofCajalinterstitialcellstoobservetheeffectoftherecombinantadenovirusvectoronchangesofmonotypeofCajalint

4、erstitialcells.MethodsTherecombinantadenovirusAdGFP/SCLwasrapidlyconstructedbyusingAdEasysystembasedonthehomologousrecombinationinbacteria.Then,Cajalinterstitialcellsculturedinvitrowereinfectedwith1.6×109pfuofrecombinantadenovirus.Thedistributionandefficiencyofrecombina

5、ntadenovirusmediatedhSCLwasobservedbyexpressionofgreenfluorescenceprotein(GFP)underthefluorescentmicroscope.TheexpressionofhSCLmRNAtransfectedwithCajalinterstitialcellswasmeasuredbyRTPCRmethod.ResultsRestrictionendonucleaseandPCRanalysesconfirmedthatthehSCLgenewassuccess

6、fullyinsertedintotheadenovirusvector,withtiteroftherecombinantadenovirusfor1.6×1011pfu/ml.Theadenovirushadahightransfectionefficiencyupto100%.RTPCRanalysisshowedexpressionofhSCLmRNAinCajalinterstitialcellstransfectedbyhSCL.Conclusions6Therecombinantadenoviruscontaininghu

7、manhSCLgeneissuccessfullyconstructedbyhomogenousrecombinationinbacteriaandithasahightransfectionefficiencyandcanmediateexpressionofCajalinterstitialcells.【Keywords】Adenovirusvector;Stemcellleukemiagene;Homogenousrecombination;Transfection;Cajalinterstitialcells干细胞白血病(stem

8、cellleukemia,SCL)基因最早发现于T淋巴细胞急性白血病细胞内，编码一种螺旋环螺旋类转录因子。研究证明SCL是ckit上游的重要调控基因，通过作用于ckit基因启动子调节c