egfp基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

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1、EGFP基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究作者：郑立恒魏会平许松梅何波杨明理王黎明刘全胜【摘要】目的:探讨外源性EGFP基因转染修饰兔骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的可行性。方法:用增强型荧光绿色蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)作为报告基因，以脂质体法转染骨髓间充质干细胞，观察转染结果、表达情况及对靶细胞活力的影响。结果:经荧光显微镜下观察证实：成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染。结论:兔骨髓间充质干细胞能

2、够在体外适宜的条件下进行长期培养;骨髓间充质干细胞可直接作为基因靶细胞,建立稳定表达EGFP的骨髓间充质干细胞系具有可行性,为进一步做标记的MSCs细胞的移植研究奠定基础。【关键词】增强型绿色荧光蛋白（EGFP）；转染；骨髓间充质干细胞（MSCs）【ABSTRACT】Objective:Tostudythefeasibilityofexogenousgenetransfectingintobonemarrowmesenchymalstemcells(MSCs).Methods:MSCswerecu

3、lturedandtreatedwithpEGFPC1withthehelpoflipofectamine.Thetransgeneresultswereconfirmedbyfluoroscopyandthecellviabilityaftertransfectionwasevaluatedbylightmicroscopyandelectron6microscopy.Results:BonemarrowMSCsweresuccessfullytransfectedwithpEGFPC1gene

4、.Conclusion:TheMSCsoriginatedfromratbonecanbeculturedinvitrounderappropriateconditions,andtheycanbedirectlyusedasgenetargetcells.Moreover,itisfeasibletoconstructtheMSCsexpressingEGFPstably,whichcanbefurtherappliedtolabeltargetcellsinthetransplantation

5、study.【KEYWORDS】Enhancedgreenfluorescentprotein(EGFP);Transfection;Mesenchymalstemcells(MSCs)间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）由于具有自我更新，多向分化的潜能，且容易获取和体外扩增培养，成为近年来干细胞研究的热点。迄今为止，国内外已对MSCs培养、生物学特性及治疗应用等进行了大量研究，展示了这种成体干细胞良好的应用前景[1~4]。对MSCs研究主要包括：细胞特异性表面抗原、

6、体外大量扩增技术、干细胞可塑性、细胞体内分布功能和治疗应用等。我们利用建立的MSCs培养，通过质粒转染并筛选培养对其用增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）进行标记，为其应用于干细胞移植实验打下良好基础。1材料和方法611材料pEGFPC1质粒（本室保存），G418购自GIBCOBRL公司，胎牛血清、脂质体转染试剂盒购自Roche公司，DMEM培养基购自Hyclone公司，PERCOLL细胞分离液购自天津TBD公司，日本大耳白兔购自四川大学动

7、物中心。12方法121兔骨髓MSCs的培养（1）原代培养：在无菌条件下，从日本大耳白兔股骨转子处进行骨穿，抽出骨髓细胞抗凝后用DMEM培养液进行稀释，将细胞悬液缓慢加入离心管中PERCOLL分离液（密度1073g/ml）液面，进行离心，DHanks液洗涤两次，分离细胞，加入DMEM低糖型完全培养液（10%胎牛血清），接种于培养瓶中，48h后首次换液，以后每三天换液一次，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养[5]。（2）传代培养：待细胞克隆完全形成后，进行胰酶消化传代。当第二代细胞长满时，将

8、稳定生长的细胞传入25mm培养盘中，当细胞生长至50%~80%融合后进行转染。122基因转染按脂质体转染试剂盒说明书进行操作，实验中设未转染的细胞作为对照。123阳性克隆的筛选和荧光显微镜观察6细胞转染48h后用荧光显微镜观察瞬时转染效率，然后换筛选培养基，其中加入G418（400×106g/L），三天换液一次，维持筛选作用。期间用普通显微镜观察细胞死亡情况。两周后对照细胞完全死亡，转染细胞单克隆形成，此时进行荧光显微镜观察稳定转染效率并照相。2结果21MSCs细胞的形态观察(1)