bfgf基因转染兔骨髓间充质干细胞同珊瑚骨体外复合培养的实验的研究

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1、bFGF基因转染兔骨髓问充质干细胞同珊瑚骨体外复合培养的实验研究摘要bFGF基因转染兔骨髓间充质干细胞同珊瑚骨体外复合培养的实验研究专业：口腔医学硕士生：蒋柳宏导师：郑有华副教授摘要骨缺损是临床常见病，各种创伤、感染、肿瘤切除、病理发育等因素均可造成骨缺损。较小的骨缺损能自行修复，骨缺损较大时则难以完成自行修复，大的骨缺损需要植骨材料修复。目前临床上用来修复缺损的材料主要有：自体骨、异体骨、异种骨、人工材料等，这些材料各有利弊，均难以达到修复骨缺损的理想材料要求。近年来采用骨组织工程技术，将细胞与特定支架材料联合培养，形成有生命活性的组织工程化复合材料，用其修复骨缺损已经取得了初步成效。同

2、时人们还发现多种细胞因子参与骨的生长和代谢，在骨缺损局部应用这些细胞因子能促进损伤愈合，其中碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)是一种能广泛促进来源于中胚层和神经外胚层细胞增殖的生物活性物质，在体内含量甚微，但它具有广泛的生物学效应。但是细胞因子的局部应用存在以下缺点：第一，局部应用的细胞因子半衰期很短，使其难以在骨损伤修复中发挥充分作用：第二，损伤局部的出血、软组织血液循环可稀释、带走细胞因子；第三，人工提取的细胞因子价格昂贵。因此现在多数研究通过基因工程技术和组织工程技术相结合，将细胞因子基因转染细胞，一方面利用移植细胞高效分泌的细

3、胞因子促进骨损伤修复：另～方面移植细胞可增殖、分化，合成细胞外基质，完成修复过程。bFGF基因转染兔骨髓问充质下细胞同珊瑚肖’体外复台培养的实验研究摘要目的一采用骨组织工程技术，以骨髓问充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)为种子细胞，转染bFGF基因后，观察bFGF对体外培养的骨髓基质干细胞增殖分化的影响；转染bFGF基因的骨髓间充质干细胞，以珊瑚人工骨为支架进行体外复合培养，观察支架的细胞相容性，为进一步的体内实验奠定基础。材料与方法1．MSCs的获取及纯化培养：穿刺抽取新西兰大白兔胫骨骨髓，采用密度梯度离心法分离MSCs，再采用贴壁筛选法对分离出的MSCs进

4、行纯化。2．MSCs成骨诱导培养：对获得的部分MSCs用矿化诱导液诱导培养20天，进行Vonkossa染色。3．bFGF．pcDNA3重组表达质粒的提取：DH一5Ⅱ菌(含牛bFGF—pcDNA3真核表达载体)扩增，用UNIQ一10柱式质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，并对所得质粒酶切鉴定。4．bFGF．pcDNA3转染MSCs：利用脂质体转染bFGF—pcDNA3到MSCs，G418筛选获得抗性克隆。培养扩增后进行免疫组化和westem--blot检测鉴定表达产物。5．转染细胞增殖特性检测：利用MTT法检测转染细胞的增殖活力，并绘制生长曲线：利用流式细胞仪检测转染细胞的增值周期。6转染细胞同珊瑚

5、人工骨的复合培养：将转染细胞制成细胞悬液，滴加至珊瑚表面复合培养，电镜观察珊瑚骨表面细胞的生长情况；利用MTT法检测复合培养情况下转染细胞的增殖活力。结果l获得大量形态均一的MSCs，部分细胞经成骨诱导培养后，Vonkossa染色可见黑色结节。2．获得bFGF．pcDNA3重组表达质粒，经酶切鉴定，重组质粒含有bFGF目的基因片断。【IbFGF基因转染兔骨髓间充质干细胞同珊瑚骨体外复合培养的实验研究摘要3．脂质体介导bFGF—pcDNA3重组表达质粒转染MSCs，获得G418抗性克隆，经免疫组化和westem--blot检测，证实转染细胞确实表达bFGF，并且表达部位在胞浆。4．转染细胞增

6、值活力加强，生长曲线上移，处于增殖周期的细胞比例加大。5．扫描电镜观察转染细胞在珊瑚支架上生长良好，MTT检测表明转染细胞在珊瑚支架生长未受到抑制。结论1．通过密度梯度离心和贴壁筛选相结合的方法可以成功分离获得MSCs。2．用脂质体转染法能将bFGF-pcDNA3重组真核表达载体成功导入体外培养的MSCs，筛选得到稳定表达bFGF的MSCs，自身表达的bFGF可以促进MSCs增殖。3．珊瑚人工骨具有良好的细胞相容性，具有广阔的应用前景。关键词：基因转染，组织工程，碱性成纤维细胞生长因子，骨髓间充质干细胞珊瑚人工骨lIIbFGF基因转染免骨髓问充质二F细胞同珊瑚骨体外复合培养的实验研究英文摘

7、要AnexperimentalstudyofcompositeculturebyseedingMSCstransfectedwiththebFGFgeneoncoralinvitroMajor：stomatologyName：Jiangliu—hongSupervisor：Zhengyou—huaABSTRACTBonedefectswerecommonconditionscausedbytrauma，neoplasmo