兔骨髓间充质干细胞定向成骨诱导复合异种松质骨修复兔尺骨骨缺损的实验研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterAnexperimentalstudyonrabbitosteogenicinducedbonemarrowmesenchymalstemcellscombinedwithxenogeneiccancellousboneforrepairingofbonedefectinrabbitulnaBySenYangSupervisor：Prof．FumingFengDepartmentofSurgerytheFonhAffiliatedHospitalofZhengzhouU

2、niversityApril2014原创性声明lqUlllll(IHINIIIllIHIY2545396本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：／70勿森日期：伽垆细件日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版

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4、细胞来源及合适的支架材料寻求一种新的方法。方法先取新生24h内新西兰大白兔颅盖骨，采用改良酶消化法提取兔成骨细胞(osteoblast，OB)；再取2周龄新西兰大白兔四肢长骨，采用密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞(BMSCs)。通过细胞形态学观察、细胞化学染色、MTT法测定细胞增殖等检测，对两种原代细胞进行鉴定。取第3代BMSCs和OB，应用Transwell双层细胞培养板将两种细胞共同培养，实验共设三组：A组上室接种OB，B组和C组上室均未接种细胞，B组使用成骨诱导培养液培养，C组使用BMSCs生长液培养作为空白对照组，三组培养下室均接种BMSCs。通过细胞形态学观察、茜素红染

5、色、BMSCs上清液中碱性磷酸酶和骨钙素测定，RT-PCR检测骨钙素和I型胶原蛋白mRNA的表达，对诱导后的细胞进行鉴定。取检疫合格的猪股骨髁部松质骨，经处理制成生物型异种松质骨。使用前BMSC生长液浸泡6h，晾干后接种定向成骨诱导的BMSCs，体外培养一周，显微镜下观察成骨诱导的BMSCs在异种松质骨支架上的粘附、生长情况，MTTI中文摘要法测定支架上细胞增殖情况。取6月龄新西兰大白兔36只，采用完全随机抽样的方法，抽取30只新西兰大白兔每组15只作为实验组和对照组，其余6只作为空白对照组，随机选取一侧前肢制作尺骨中段15mm节段性骨缺损模型。按照植入物不同分为三组：实验组：缺损

6、处植入成骨诱导的BMSCs复合异种松质骨：对照组：缺损处植入异种松质骨；空白对照组：不植入任何材料。于术后4、8、12周3个时间点每组处死5只实验动物取标本，通过X线检查、标本大体观察和骨缺损区HE组织化学染色，及术后12周兔尺骨缺损区几何参数测量，比较各组骨缺损的修复情况。挂甲：口7f孓1．细胞的提取和鉴定：密度梯度离心法提取BMSCs，操作简单、细胞纯度高，得到的细胞呈长梭形；改良酶消化法提取成骨细胞，耗时短、细胞产出率高，得到的细胞呈短梭形或多角形。两种原代细胞经鉴定为骨髓间充质干细胞和成骨细胞。2．BMSCs定向成骨诱导分化：Transwell双层细胞培养板法和成骨诱导液培

7、养法两组细胞上清液中AKP、OCN含量在同时间检测点上检测结果显示两者无明显差异(P>O．05)，两组成骨诱导后的细胞茜素红染色均为阳性，RT-PCR检测两组成骨诱导的细胞OCN和CollagenI的mRNA均有表达。3．异种松质骨的制备与成骨诱导的BMSCs复合培养：经去抗原处理后的异种松质骨，外观呈白色至淡黄色、疏松多孔状。接种细胞后显微镜下观察细胞在异种松质骨支架材料上生长良好，MTT法测定结果显示随着培养时间增加细胞数量增多。4．骨缺损修复实验：X线观察：术后