去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损论文

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1、去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损论文王德超郑玉琴孙建华史晨辉董金波刘维钢【摘要】目的：研制理想的能够修复骨缺损的骨材料，为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。方法：体外扩增诱导兔骨髓基质干细胞，将其与去细胞牛松质骨复合培养。造成兔桡骨中段10mm骨缺损模型，分复合细胞组、单纯材料组、空白对照组。通过大体观察、放射学检查、组织学检查观察骨缺损的修复情况。结果：去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损，12周时缺损区完全被新骨代替，骨髓腔完全通畅，优于单纯材料组的修复效果，单纯材料组优于空白对照组。结论：去细胞牛松质骨具有良好的成骨

2、能力.freelaterialfortherepairofbonedefect,fortheclinicaluseinthebonereconstructionfield.MethodsRabbitmarrocells(MSCs)ixedodelofbonedefects,dividedinto3groups:namedplexgroup,acellularbovinecancellousbonegroup,andblankcontrol.Theanimalseninspection,X-rayexaminationandhistologicalobser

3、vation.ResultsAt12edplexgroup,andtheirmarroed,aybeusedasakindofidealscaffoldmaterial.〔KeySCs）与去细胞牛松质骨载体相结合，构建组织工程骨，探索修复兔桡骨节段性骨缺损的可行性。1材料与方法1.1材料1.1.1材料与试剂新鲜牛肱骨（石河子市农贸市场），脱细胞的各种试剂（曲拉通X-100由上海生物工程公司提供，氯化钠由西安化学试剂厂提供），Hassion染色试剂盒（广州市俪科贸易有限公司），新西兰大白兔（石河子大学实验动物中心），胰酶（华美），地塞米松（Sigma），维生

4、素C（Sigma），β-甘油磷酸钠（Sigma），低糖DMEM培养基（GIBCO公司），新生牛血清（Hyclone，美国），小牛白蛋白血清（Sigma），60Co辐射源（加拿大），倒置荧光显微镜（Olympus），电镜（LEO-1430VP，德国）。1.1.2牛松质骨标本的准备取新鲜牛肱骨1/3段，制成1.5cm×0.5cm×0.5cm大小，50℃自来水反复冲洗3次后，蒸馏水冲洗3次，置于PBS保存液中，在适宜的温度、pH值条件下，采用10%高渗生理盐水和去污剂TritonX-100对牛肱骨进行组织工程学的去细胞处理。包装后60Co照射（20kGy）备用。

5、1.2方法1.2.1骨髓基质干细胞的分离、培养、诱导鉴定1月龄新西兰大白兔，3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，无菌条件下取双侧股骨，用含有肝素的PBS缓冲溶液冲洗骨髓腔，冲洗液5mL缓慢加到已加入了5mL淋巴细胞分离液的10mL离心管中，2000r/min，离心30min，用吹打管轻轻取其界面云雾层液面，PBS漂洗，1500r/min离心5min，弃上清，加入基础培养液DMEM10mL，制成单细胞悬液，3×106/mL接种于75mL培养瓶内，加5mL20%胎牛血清的低糖DMEM培养基，置于5%CO2、37℃饱和湿度的CO2孵箱中进行培养，72h后全量换液。以后每隔7

6、2h换液1次。待贴壁细胞融合达80%~90%后，0.25%胰蛋白酶37℃下消化，进行传代、扩增培养。收集第3代BMSCs，以2×104/mL的密度培养于诱导培养液（含20%新生牛血清，10-8mol/L地塞米松，50L/mL维生素C，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠）。同时以同样密度细胞培养于20%新生牛血清低糖DMEM（L-DMEM）培养液为对照。在第21天分别取出贴壁生长有细胞的盖玻片，使用75%乙醇固定液固定30min。三蒸水冲洗，用5%的硝酸银染色，避光，室温孵育30min。再以三蒸水冲洗，在紫外灯下照射30min。以1%中性红溶液染色30s。1.2

7、.2BMSCs细胞与ABCB复合培养收集第3代BMSCs，加入含成骨细胞诱导液的条件培养基培养3d，制成5×106/mL浓度的细胞悬液进行接种，每孔2mL。利用抽吸作用力使细胞充分渗入ABCB孔隙中，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下联合培养，8h后再次加培养液，其后隔日换液。复合培养3d。1.2.3采用健康成年新西兰大白兔27只，重2.2~2.5kg，无菌条件下造成桡骨中段10mm骨缺损模型。先取18只，将直径5mm、长10mm的复合骨髓基质干细胞牛去细胞骨植入左侧骨缺损处，右侧单纯植牛去细胞骨；再取9只，双侧留做空白对照。术后肢体不作外固定。每日肌注青

8、霉素20万U，连续3d。术后4、8、12周每个时间点实验组6只，对