人骨髓间充质干细胞复合生物陶瓷体外成骨能力实验的研究

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1、摘要目的：建立体外分离、培养和鉴定hMSCs的方法体系：探讨贝奥路生物陶瓷复合hMSCs的生物相容性及诱导成骨能力，并评价其构建组织工程骨的可行性及临床应用价值。方法：1建立hMSCs体外分离、培养和鉴定的方法体系。用Pcrcoll梯度分离液离心分离单个核细胞后，置于37℃、5％C02、饱和湿度孵箱培养、传代扩增。倒置显微镜观察；测定其生长增殖曲线；酶联免疫法行细胞表面抗原检测。取生长状态良好的第三代hMSCs，用成骨诱导液培养；倒置显微镜逐日观察细胞形态变化；行碱性磷酸酶染色和Von--Kossa法钙结节染色。2hMSCs复合贝奥路生物陶瓷体外成骨能力的实验研究。实验组：细

2、胞和生物陶瓷复合体；对照组：以相同的细胞数接种到12孔培养板内。实验组和对照组细胞在相同的条件下行成骨诱导。倒置显微镜及扫描电镜观察细胞形态变化；MTr检测其生长增殖情况；碱性磷酸酶染色及定量检测测定其变化情况：Von---Kossa法钙结节染色。行统计学分析，假定P<0．05有统计学意义。．结果：1密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离提纯hMSCs，体外培养的原代细胞在48h内有少量细胞贴壁，随后形成纺锥状成纤维细胞样集落单位，随着培养时间的延长，细胞形态逐渐趋于一致；细胞生长增殖活跃；CD29和CD71表达阳性，CD34表达阴性。在诱导培养的第3天碱性磷酸酶染色阳性，第7

3、天Von—-Kossa法钙结节染色阳性。2hMSCs能够贴附在贝奥路生物陶瓷表面及孔隙内生长；实验组和对照组细胞的生长曲线形态一致，在诱导培养早期、中期的OD值无显著性意义(P>0．05)，而晚期(第9天和第10天)差异有显著性意义(P<0．05)；实验组和对照组细胞在诱导的第3天碱性磷酸酶染色阳性，但两组在各时间点碱性磷酸酶定量检测有统计学意义(P

4、2贝奥路生物陶瓷和hMSCs的生物相容性良好；三维空间诱导优于平面诱导；贝奥路生物陶瓷具有骨传导和骨诱导作用，可作为骨组织工程的支架材料与hMSCs构建组织工程骨。关键词：人骨髓间充质干细胞；生物陶瓷；成骨能力；组织工程骨；体外ⅣAbstractABSTRACTobjectives：Toestablishthemethodssystemofseparation、cultureandidentificationofhMSCs；toinvestigatethebiocompatibilityandosteogenesiscapabilityofbio-lubioceramicco

5、mpoundswithhMSCsandtoevaluatethefeasibilityofconstructingtissueengineeringbonewiththemandtheirpracticalvalueinclinic．Methods：IToestablishthemethodssystemofseparation、cultureandidentificationofhMSCsinvitro．BonemarrowmononuclearcellswereobtainedbyPercollgradientcentrifugation，andthenwerepurif

6、ied，subculturedandexpandedinincubatorwith5％C02，saturatedhumidityat37。C．Thecell’Smorphologywasobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope；thegrowthcurvewasdrewbyMTT；thecellsurfaceantigenswereexaminedbyimmunocytochemistry．Vigorouspassage3hMSCswereculturedinconditionedmediumsupplementedofDex10一m

7、ol／L、13-GP10mmol／LandAA50烬几．Thecellgrowthstatusandmorphologywereobservedunderinvertedmicroscopeeveryday；cytochemicalstainingfortheactivityofalkalinephosphatase(AKP)andVon--kossastainingforcalcifiednodues．2Theexperimentalstudyofbio-lubioceramiccombineshMS