人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究

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1、人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究【摘要】目的：研究人骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）在体外培养过程中的增殖和成软骨分化现象和规律。方法：以密度梯度离心法分离健康成人髂骨MSCs，观察体外培养过程中细胞形态、生长和增殖现象。取第三代细胞给予地塞米松，维生素C和不同剂量转化生长因子β1（transforminggroenonandruleofmultiplicationandchondrogenesisofmesenchymalstemcells(MSCs)derivedfromhumanbon

2、emarroIliumandpurifiedbydensitygradient.Toobservetheconformation,groultiplicationofMSCsculturedinvitro.SCsandinducedthemintochondrogenicdifferentiationethasone，VitaminCandTGF-β1indifferentdosageformedchondracytesinduction.After3easuredthesulfateglycosaminoglycanmunoflu

3、orescenceandglycosaminoglycanetry.Results：MSCscanbeculturedostevidentexpression.Conclusion：MSCshavestrongabilityofmultiplicationandcouldbeinducedintochondrocytesundercertaincircumstances.TGF-β1isthemajorfactorofchondrogenesisesenchymalstemcells;chondrogenesis;TGF-β1　　各

4、种由创伤和疾病引起的关节软骨缺损在临床上十分常见,目前临床上尚无有效的治疗方法。近年来组织工程技术的发展给修复关节软骨缺损带来了希望。最近的比较研究证实骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs)是修复全层软骨缺损的最佳细胞源［1］。笔者采集健康人骨髓，以密度梯度离心法分离人MSCs，行体外培养扩增及成软骨诱导，希望为临床治疗软骨缺损提供参考。　　1材料与方法　　1.1对象　　骨髓标本取自3名健康成年男性自愿者（28，34，37岁）髂后上棘。3人均无全身性疾病和代谢性疾病。取得知情同意后，无菌条件下抽取骨髓

5、5ml置于抗凝环境。　　1.2主要试剂　　L-DMEM培养基（Gibco公司），类标准胎牛血清（民海生物公司），转化生长因子（TGF）-β1（美国Peprotech公司），维生素C、地塞米松、胰蛋白酶、硫酸软骨素（Sigma公司），人淋巴细胞分离液Ficoll（天津灏洋生物公司），兔抗人二型胶原多克隆抗体、浓缩型Cy3-SABC免疫荧光试剂盒（博士德公司）。　　1.3人MSCs的分离和体外培养　　取2.5ml骨髓加入等量PBS稀释，吹打混匀，贴壁缓慢加入已有5mlFicoll分离液的离心管。2000r/min离心20min，吸取界面

6、云雾状白膜层（富含MSCss）。加入PBS,800r/min离心10min洗涤2遍，计数。以5×106/cm2接种于细胞培养瓶，加入完全培养基（含10％胎牛血清的L-DMEM培养基）。培养48h后半量换液，弃去不贴壁的杂细胞。以后2～3d换液1次，7～10d即可见较多贴壁细胞。细胞90％融合时0.25％胰酶消化，1∶3传代培养。连续培养三代后MSCs基本纯化。取第三代细胞按1×105/cm2接种96孔板，于传代后8d内每天取10孔行MTT检测，绘制传代细胞生长曲线。　　1.4成软骨细胞诱导培养　　配制成软骨诱导条件培养基①～④号：完

7、全培养基加地塞米松（10-8mol/L）,TGF-β1（0，5，10，20μg/L）、维生素C（10mmol/L）。取长势良好的第三代MSCs，分4组（命名为A,B,C,D）分别按1×105/cm2接种于含条件培养基①～④号的24孔板（每组12孔）。每日用倒置相差显微镜观察细胞形态。另取4个6孔板，按1×105/cm2接种长势良好的第三代MSCs，分别用条件培养基①～④号诱导培养3周，用以检测蛋白多糖（proteoglycan，PG）含量。　　1.5软骨细胞检测　　定向诱导培养3周后，用4%低聚甲醛固定24孔板中细胞20min后行以

8、下检测。（1）甲苯胺蓝染色：用70%乙醇、浓度为0.2%甲苯胺蓝染色1min，再以95%的乙醇分色10min，纯丙酮脱水2次，每次5min，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。（2）阿利新蓝染色：用pH2.5的阿利新蓝染色30min，蒸馏