骨髓间充质干细胞体外诱导分化研究进展

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　　骨髓间充质干细胞体外诱导分化研究进展【摘要】骨髓间充质干细胞（MSC）是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体，MSC既具有干细胞的特性又具有明显的可塑性，获取简便，体外培养条件不高，分离增殖能力强，可以自身获取，因此它可以作为种子细胞。与造血干细胞相比，MSC在疾病治疗上更为理想。目前MSC及其在组织工程方面的研究已取得较大进展。【关键词】骨髓间充质干细胞；体外诱导分化；组织工程修复干细胞是指具有高度增殖和多向分化潜能的幼稚细胞。骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC）是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体，能在适宜的条件下分化再生骨、软骨、肌肉、肌膜等间充质组织。现将骨髓间充质干细胞体外诱导分化研究进展综述如下。　　1不同诱导条件下的多向分化　　MSC低密度接种后，可呈克隆样生长，其中部分具有多方向分化潜能，部分只有单一的分化潜能。骨祖细胞有两种类型，第一类可以在体外标准的培养环境中（维生素C， β磷酸甘油钠盐，胎牛血清），不需外源性诱导物质的条件下自动分化成骨。而另一类则需加入诱导剂，如地塞米松或类固醇。人类MSC在体外培养中，其向成骨方向分化能力能保持40代。该过程中许多外源性的因子起双相性作用—抑制或促进。与作用时间，浓度或是否有其他因子参与有关。某些生长因子和（或）分化因子，在MSC分化的不同阶段所起作用也不相同。骨形态发生蛋白（BMP）在MSC选择分化中起一定作用。若选择性地阻断BMP的受体IB（BMPRIB），则MSC向脂肪细胞方向分化。若IA型BMP受体（BMPRIA）过度表达，可以阻止MSC向脂肪细胞方向分化，促进成骨。所以BMP受体的短暂表达或缺失在MSC的选择性分化中起决定性作用。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）与BMP对于MSC的成骨能力有协同作用。在MSC的培养液中加入成纤维细胞生长因子4（kFGF）可以减缓细胞衰老，延长增殖时间。糖皮质激素诱导的骨祖细胞大约分裂8次，才能变成明显的立方形，并有基质沉积。依据MSC发育分化成为可以分泌基质的成骨细胞的过程中基因表达的变化，大致将其分为三个阶段：细胞增殖期；细胞外基质发育成熟期；矿化期。在细胞增殖期原癌基因cfos及c myc等表达。骨桥蛋白在增殖期可以增加2倍，然后下降，在骨涎蛋白和骨钙素高峰前再次增加。细胞周期素B，E在增殖期后表达提高。碱性磷酸酶（ALP）在矿化过程中先增高后降低；骨涎蛋白出现于成骨细胞分化成熟后，骨钙素出现于矿化过程中。不同的成骨细胞其骨桥蛋白，骨钙素及骨涎蛋白表达不同，据此可将成熟的成骨细胞区分为若干亚群。1997年CandeliereGA等[1]指出21胎鼠颅骨内不同部位的成骨细胞在mRNA及蛋白质表达两个水平骨桥蛋白，骨涎蛋白，骨钙素。软骨内成骨的重要调节因子甲状旁腺激素相关多肽PTHrP，原癌基因cfos，生长发育的调控基因同源异型核基因msx2等表达均不相同，提示成骨细胞可细分为不同的亚群，其分泌的非胶原骨基质也各不相同。说明MSC分化成为成骨细胞过程中，依该细胞所在骨组织的位置不同，可能有不同的路径。2005年丁亮华等[2]建立的成人MSC分离扩增以及诱导和分化为成骨细胞的体外培养方法稳定且实用。MSC可以向软骨细胞方向分化，用于软骨修复。肥大的软骨细胞可以进一步分化成为成骨细胞。高度分化的脂肪细胞可以逆转至低分化、高增殖的成纤维细胞前体表型，进一步转变为具有成骨的细胞表型。分化至已表达骨钙素的成骨细胞（骨钙素是成骨细胞成熟的晚期标志物）可以在适当的培养条件下迅速完全转变为具有成脂肪表型的细胞。1999年AndradesJA等[3]分离了Fischer344大鼠MSC，在含0.5%胎牛血清（FBS）的胶原凝胶培养基中培养，发现 MSC必须依靠外源生长因子而存活。该作者制备了重组人转化生长因子（rhTGFβF2）融合蛋白，这种融合蛋白含有辅助胶原结合域，可以支持这种培养状态下的细胞生长，而TGFβ不能支持。培养10d后，接受TGFβF2作用的细胞在10%FBS中培养，DNA合成，ALP表达及骨钙素合成明显。该作者进一步报道了另一种rhTGFβF2融合蛋白，内含一个vonSC的分化。除了各种生长因子外，生物力学因素也可影响间充质组织的增生及分化。在低应力应变区内可以直接膜内成骨；低至中度的张应变和流体静力学张应力可刺激膜内骨化；血供较差可刺激软骨形成；流体静力学压应力可刺激软骨形成；高的张应变可以刺激网状纤维组织的形成；张应变与过分施加的流体静力学压应力可以加速纤维软骨的形成。　　2MSC与组织工程修复　　将骨髓来源的MSC吸附于一种含有酯化透明质酸和明胶的复合基质进行体外培养，在TGFβ诱导下，细胞外基质中检测到Ⅱ型胶原。在此基础上，将单纯复合基质（Ⅰ组），复合基质+MSC（Ⅱ组），复合基质+TGFβ诱导培养14d的MSC（Ⅲ组）分别植入裸鼠皮下，发现Ⅰ组无软骨形成；Ⅱ组基质支持软骨细胞分化；Ⅲ组中TGFβ预处理的MSC可促进软骨组织形成。说明该材料可作为组织工程的载体。2000年MasonJM[4]首次报道了基因治疗与组织工程技术联合应用 修复关节软骨损伤的实验。他们从兔骨髓内分离出MSC行体外培养，将人BMP7基因导入兔MSC，使兔MSC表达人的BMP7。体外培养、扩增后置入聚乙醇酸移植物中，接种于兔骨软骨缺损处，术后分别于4，8，12周取材，通过肉眼观察，组织切片观察，免疫组化分析判断软骨的再生情况，发现在8及12周时，实验组关节软骨已全部或部分修复，而对照组几乎无修复。2001年GaoJ等[5]报道了利用MSC构建骨软骨联合移植物的可行性。该作者从大鼠骨髓内分离出MSC，体外培养，扩增后分别用TGFβ诱导向软骨方向分化，用成骨诱导因子向成骨方向分化。将向软骨方向分化的MSC吸附于透明质酸提取物（HYAF11）构成的海绵状支架。将向成骨方向分化的MSC吸附于多孔磷酸钙陶瓷，通过纤维蛋白封闭剂将二者连接形成一个整体。植入同基因大鼠的皮下，植入后第3周、6周取材进行形态学分析及Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅹ型胶原免疫组化染色。结果证实该二部分成为一个整体，胶原纤维贯穿于陶瓷载体及HYAF11载体，在HYAF11载体处有纤维软骨形成，有Ⅱ型胶原分布，在陶瓷载体处有骨形成。在这两种载体处均发现有Ⅰ型胶原分布。该实验提示采用组织工程技术进行骨与软骨的联合移植是可行的。在直径为5mm的全层软骨缺损区、局部连续使用FGF2（50pg/h）2周，关节软骨和软骨下骨可以再生。在这些缺损中，未分化的MSC起动了软骨分化。在直径为3mm 的软骨缺损中，局部使用FGF2的单克隆中和抗体（50ng/h）2周，缺损处无关节软骨再生，由纤维组织充填。说明局部使用FGF2可以使直径5mm的软骨缺损成功修复，其靶细胞就是MSC。2005年戚超等[6]报道了MSC与生物衍生骨复合修复山羊股骨缺损，结果显示所构建的组织工程骨修复能力强，成骨迅速。将MSC体外扩增后接种于胶原凝胶，用于修复跟腱缺损时，在伤后4周、8周、12周其抗拉强度是单纯缝合的两倍，表明MSC可以分化为腱细胞，将MSC以100万细胞/ml，400万细胞/ml，800万细胞/ml三个密度接触于胶原凝胶，植入体内肌腱缺损处，发现400万细胞/ml组和800万细胞/ml组在外观及收缩性能上无区别，而100万细胞/ml组收缩速度慢，在植入后72h，肌腱直径比高密度接种组粗62%~73%，在肌腱收缩过程中，MSC重排而且细胞形态变长，高密度接种组细胞重排较好，而且核变长。在胶原纤维收缩应力刺激下，可能会激发MSC向成纤维细胞方向分化，并影响细胞的合成能力。2001年UedaM等[7]报道了组织工程技术在口腔科的应用，分为两种类型：硬组织工程和软组织工程。对于硬组织工程，制备家兔的窦道强化模型，采用人重组BMP2及MSC修复了家兔的窦道。对于软组织工程，以培养的上皮移植物用于口腔内软组织的修复。2003年Hori Y等[8]报道了以Beagle狗为动物模型，将小肠切断，分离MSC，体外培养，接种于胶原海绵，填充小肠缺损处（约5cm），4周后发现了小肠的再生。在再生处，发现了α平滑肌肌动蛋白阳性细胞；但该阳性细胞在16周时消失，仅有薄层平滑肌再生，此问题尚待进一步研究。2001年日本FukudeK等[9]将分离出的兔MSC，放于培养液中并加入5氮杂胞苷，1周后30%的细胞外形发生改变，同相邻的细胞连接，呈类似肌管的结构；2周后，出现自发性搏动；3周后，出现同步性搏动，并有心房利钠肽（ANP）和脑利钠肽（BNP）表达，电子显微镜检查发现该细胞呈现类似心肌细胞的超微结构，包括典型的肌节和心房颗粒，具有窦房结或房室结的功能。通过对收缩蛋白的异构重整基因分析，这些细胞在5氮杂胞苷处理前表达心脏发育早期转录因子Nkx2.5，GATA4，转录增强因子TEF1，MEF2C。处理后表达心肌细胞增强因子MEF2A和MEF2D。此结果提示这些细胞类似于胎儿心室细胞。该研究为MSC用于心肌细胞移植提供了理论支持。2001年CaiD等[10]在体外培养的兔及犬的MSC细胞中找到了异构重整的α平滑肌肌动蛋白基因（SMA），通过免疫组化银染色及A蛋白，其含量随着传代次数的增加而提高，该发现提示许多骨髓肌肉结缔组织细胞中含有SMA基因的原因是其MSC分化而来。　　3展望 　　目前造血干细胞及胚胎干细胞在治疗血液病，遗传性免疫缺陷，心脏疾病等方面取得了显著的成就。理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，而且较传统方法具有很多优点。MSC既具有干细胞的特性又具有明显的可塑性，获取简便，在体外可以通过贴壁培养加以分离，体外培养条件不高，分离增殖能力强，可从自身获取。许多实验证实MSC可分化为多种间充质组织，因此有人认为MSC可能是保留于成年组织器官中的胚胎干细胞或具有胚胎干细胞的特性，而定向分化的关键就是诱导分化的条件，因此可作为种子细胞。许多学者认为与造血干细胞相比，MSC在疾病治疗上更为理想。MSC及其在组织工程方面的研究虽然已取得了较大进展，但仍有许多问题有待解决，比如MSC经体外大量扩增后如何能很好地保持其多能干细胞的生物学特性，如何既控制MSC增殖，又能在适当的时候调控MSC定向分化，如何更好地促进MSC与理想材料相容生长等。相信对该细胞的进一步研究必将推动组织工程科学的发展。【参考