骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞

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1、中国医科大学硕士学位论文骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞姓名：刘朝阳申请学位级别：硕士专业：细胞生物学指导教师：庞希宁20030401中文摘要背景与目的骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是具有多向分化潜能的成体干细胞，除了能向多种中胚层组织细胞分化，如骨软骨和脂肪细胞外，还可以诱导分化成非中胚层的细胞组织如：神经细胞，肺泡和小肠细胞。骨髓MSCs取材容易，来源充足，分离和培养技术比较成熟。自体MSCs诱导分化后进行移植治疗，解决了异体细胞免疫排斥的问题。MSCs的神经分化是非常有意义的：如果我们能找到合适的分化方法

2、和诱导剂，我们就可以应用分化后的细胞来治疗多种神经疾病，如截瘫、中风，帕金森氏症等。在寻找诱导剂方面，Sanchez—Ralnos，Woodbury，Kohyama，Reyes和VerfaiUie工作主要集中在神经因子和抗氧化剂如beta一巯基乙醇等。在地球的另一边，中国的科学家在使用中药的提取物诱导MSCs分化成神经细胞方面也取得了很好的实验结果。／在本试验中，测试了几种抗氧化剂对MSCs的影响，以分析抗氧佬剂对MSCs神经分化的影响。结果显示，只有beta一巯基乙醇具备此种诱导能力，排除了谷胱甘肽、抗坏血酸、维生素E等抗氧化剂的作用。本实验使用了bet

3、a一巯基乙醇、无血清的DMEM培养液和DMSO作为诱导方案，在诱导后，可见很多诱导产生的神经元样和胶质细胞样细胞。诱导MSCs分化成神经细胞的目的主要是研究其分化的机制，以及将来应用于临床治疗神经系统损伤和退行性病变疾病(如截瘫、中风，帕金森氏症)。窭骏材辩与方法墩2—4冀龄WISTAR犬鬣。颈椎脱位法处荭必鬣。无茵絷傣下黻黢嚣穰胫骨懿嚣髓，熬入5ml含10够舱簪巍漪瓣DMEM培莽液1000rpm离心10分耱，收打，加入鼹个培养瓶，置入37℃，5％C02，饱和湿度条件下培莠，隔日更换培养漩，当细胞达到钧％融合嚣尊，传代。卷传到第五代时，取一簸MSCs恩胰懿

4、淡他，隧8×103／e蠢浓度接辩农六魏板巾瓣盏玻抟上，藏爨凳疫缨旅讫学寅法梭测CD45，CI)90的表达。分别取第5代和第13代的MSCs，以8×l妒／em2浓度接种等六魏板中的盖玻辟上，镪备细臆鹈片，每孔攘2mL培养液。达戮80锡融合时，更换凝鳞嫱养液，势在培养滚孛掷入终浓度力ImM的鍪一巯蒸乙簿，诱静2瘁小时，PBS洗涤，两精撬寝笼血清的璜莽液。5小游藤用客2％DMSO麴诱导液鲶理5个小对。取诱簿l§小时籍的缨臌，参照博士德公司的SABC试瓣盒操俸方法进褥免疫缨施化学实验。一抗势NSE，二挽努与一挽攘对廒的抗体。对照绲为未经处理的缨胞和用PBS代嚣一抗

5、的纲稳。实验缩暴瓣分离的MSCs贻壁蘑墨圆形，骢蒋遴蹇，折光幢好，与遗斑继鼹混杂。在换液去除未黼壁细脆，不断培养串，MSCs黻外的遗蛊缫簸被去除，MSCs鑫然缝纯。MSCs形态瞧是誉垮一戆，哥泼避瑰多辩形态：长梭形，失{l豸藕平，小蔼多颗粒懿细臆等。免疫缨臆优学狻滋CD45帮CD90戆结果，可觅CD45完全阴性，CD9070％熙燃。农MSCs蘸诱导屠，缨胞的形态变化不明显，大致上纲臌的边缘窝褥誉是缀规熬，有很多鹣攒状突藤。在掇捧纛漪≤鄹簧羧·2·为茏擞清静DMEM培养液)藩20分钟凑，黪有细胞发生赞显懿形态变化：细胞体开始收缩，臆体发亮(携光攮强)，有些缨

6、胞的细胞质分裂星现多突起的外观。细胞最终成为三角形、锥形，星形，和长锥形等。一些缨赡醚似棒经缨胞。但是凑待魂浆学研究。所以称海类似神经细胞。(Neuron—likecells)。免疫细胞化学染色终果：未诱导的细胞表达极其微量的NSE，菇一抗对照组完全阴性，而诱导的细胞80％以上表达NSE，NSE表现为弥漫的胞浆着色。讨论蚤髓闻充质细臆是嚣蓠研究比较热鹃一种成体于细稳，对于它熊分化鲍多离性科学家茏其感兴趣。凌各魏诱导荆孛，选择穗应的秃毒的诱导剂是至关重要的。掇褒MSCs向摊经元榉缨越诱导鳇效率以及遴～步得到秘熊上与体内正常神经元一致的神经元是近颦研究的热点。

7、建立切实可行的定向诱导分化为神经元的条件，是MSCs最终运用干临床治疗多种神经系统疾病首要和必需的基础王{乍。在诱导剂的选择上，不阏的实验室采取了不同的方法，中出医科大学采用了中药的提取鐾俸隽诱导翔如：三七、紊番、丹参，缳是孛药鳓番效成分还不清楚；程国外，Woodburyetal聚用的是B一巯基己醇、DMSO和丁化羟基苯甲醚(BHA)作鸯诱导剂，但是BHA有使细胞突变的可能，数本实验并没有采取。Sanchez—Romas使用的是RA、BDNF和NGF，Kohyama镣使用的是：5一舭a—C，之后越BDNF、NGF和N褥囊§漫缨胞。本研究显暴MSCs的分化秘

8、抗戴讫捧是的关系并不骧澳，霞为单纯使用菜种抗氧化剂如：谷胱甘放、维