大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞

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1、大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞姜廷帅　蔡莉　惠延年　闫峰AbstractAIM:Toexploretheplasticityoftransdifferentiationofmesenchymalstemcells(MSC)intocornealepithelialcells.METHODS:MSCofadultratsthatentculturemethod.ThetransdifferentiationofMSCintocornealepithelialcellsalfibroblasts.Thee

2、xpressionofK12onMSCsmunofluorescentstaining.RESULTS:MSCculturedinvitroshoalfibroblastsforoneesenchymalstemcell;cornealepithelialcells;transdifferentiation摘要目的:探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性。方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSC，经体外与角膜基质细胞共培

3、养诱导分化，免疫荧光法检测角膜上皮细胞特异标志物K12的表达。结果:体外培养的大鼠骨髓MSC表现出很强的增殖潜能，原代培养的骨髓MSCCD29免疫荧光染色阳性，CD34和CD45为阴性，符合骨髓MSC的特征。MSC与角膜基质细胞共培养1esenchymalstemcell，MSC），在体外不同条件下可以定向地被诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌腱及骨髓基质等不同细胞。我们对骨髓MSC向角膜上皮细胞的分化潜能做一些初步的探索，从而探讨骨髓MSC作为构建组织工程化角膜的种子细胞的可行性

4、。1材料和方法1.1材料PBS液(含青链霉素100kU/L)；细胞培养基(DMEM/Ham’sF12,10mL/L胎牛血清)；2.5g/L胰蛋白酶；中性蛋白酶dispaseⅡ；Percoll储存液（密度1077g/L）；兔抗大鼠CD29，CD34，CD45mAb（美国Chemicon公司）、兔抗大鼠角蛋白K12mAb（美国SantaCruz公司），山羊抗兔FITC标记二抗（北京中山生物技术公司），跨室培养装置（Trans，美国Millipore公司）。1.2方法1.2.1大鼠骨髓MSC的分离培养取4L/L乙醇中浸泡10

5、min。无菌条件下用外科剪于大鼠的股骨端将大腿剪下，剪去胫骨，用眼科剪剪开皮肤，分离去除肌肉，剪去股骨两端的膨隆部分，暴露骨髓腔，用含肝素的PBS液冲洗骨髓腔，收集于培养皿，如此反复数次。在一无菌离心管中，加入Percoll液0.6mL和8.5g/LNaCl溶液0.4mL，混匀配制成密度为1077g/L的细胞密度梯度分离液。将收集的细胞悬液缓慢加在分离液的上部，2000r/min离心30min，去除上清。PBS洗2次，按2×108/L密度接种细胞于75mL塑料培养瓶中。接种48h后换液，以后每2～3d换液，观察细胞增殖

6、能力及形态学特征（倒置显微镜）。另将原代培养的MSC接种于盖玻片上，待细胞长出后，用PBS离心洗涤（1000r/min，5min）2次，把细胞片浸入950mL/L乙醇中固定。将已经固定的细胞玻片放入盖片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。滴加滴度为1∶32～64的特异性抗体(一抗，CD29，CD34，CD45，K12)，置于湿盒内，37℃保温孵育60min，另以PBS代替一抗作阴性对照。随后PBS振洗3次，吹干。滴加适当稀释的荧光素标记抗体（二抗，FITC标记的山羊抗兔IgG），置于湿盒内，37℃保温30min。P

7、BS振洗2次，然后用蒸馏水振洗1次。500mL/L缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察并照相记录。1.2.2角膜基质细胞的制备无菌条件下摘取大鼠眼球，沿角膜缘处分离出整个角膜，先用普通消化液浸泡，置于37℃30min，再用dispaseⅡ于37℃消化2～3h。消化后用PBS洗去消化下来的上皮细胞。在显微镜下观察，若发现细胞未消化干净，用眼科小镊子轻轻刮取细胞，确保角膜上皮细胞完全被消化下来。将角膜基质剪成1mm×1mm大小的组织块，放入离心管中加入4mL胶原酶，将离心管倾斜放入37℃孵箱内，每隔5min振摇一次，消化1h。

8、收集消化液，过100目不锈钢网过滤，800r/min离心，5min，去除上清，用PBS离心漂洗1～2次，去除上清，按1×107/L密度接种于25mL培养瓶中。1.2.3大鼠骨髓MSC与角膜基质细胞共培养按Millipore公司的说明，用Trans）装置进行大鼠骨髓间充质干细胞与角膜基质细胞的共培养。共培养体系中上、下层的细胞被隔开