大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞论文

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1、大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞论文姜廷帅蔡莉惠延年闫峰AbstractAIM:Toexploretheplasticityoftransdifferentiationofmesenchymalstemcells(MSC)intocornealepithelialcells.METHODS:MSCofadultratsthatentculturemethod.ThetransdifferentiationofMSCintocornealepithelialcellsalfibro

2、blasts.TheexpressionofK12onMSCsmunofluorescentstaining.RESULTS:MSCculturedinvitroshoalfibroblastsforoneesenchymalstemcell;cornealepithelialcells;transdifferentiation摘要目的:探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性。方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分

3、离纯化大鼠骨髓MSC，经体外与角膜基质细胞共培养诱导分化，免疫荧光法检测角膜上皮细胞特异标志物K12的表达。结果:体外培养的大鼠骨髓MSC表现出很强的增殖潜能，原代培养的骨髓MSCCD29免疫荧光染色阳性，CD34和CD45为阴性，符合骨髓MSC的特征。MSC与角膜基质细胞共培养1esenchymalstemcell，MSC），在体外不同条件下可以定向地被诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌腱及骨髓基质等不同细胞。我们对骨髓MSC向角膜上皮细胞的分化潜能做一些

4、初步的探索，从而探讨骨髓MSC作为构建组织工程化角膜的种子细胞的可行性。1材料和方法1.1材料PBS液(含青链霉素100kU/L)；细胞培养基(DMEM/Ham’sF12,10mL/L胎牛血清)；2.5g/L胰蛋白酶；中性蛋白酶dispaseⅡ；Percoll储存液（密度1077g/L）；兔抗大鼠CD29，CD34，CD45mAb（美国Chemicon公司）、兔抗大鼠角蛋白K12mAb（美国SantaCruz公司），山羊抗兔FITC标记二抗（北京中山生物技术公司），跨室培养装置（Trans，美国

5、Millipore公司）。1.2方法1.2.1大鼠骨髓MSC的分离培养取4L/L乙醇中浸泡10min。无菌条件下用外科剪于大鼠的股骨端将大腿剪下，剪去胫骨，用眼科剪剪开皮肤，分离去除肌肉，剪去股骨两端的膨隆部分，暴露骨髓腔，用含肝素的PBS液冲洗骨髓腔，收集于培养皿，如此反复数次。在一无菌离心管中，加入Percoll液0.6mL和8.5g/LNaCl溶液0.4mL，混匀配制成密度为1077g/L的细胞密度梯度分离液。将收集的细胞悬液缓慢加在分离液的上部，2000r/min离心30min，去除上清

6、。PBS洗2次，按2×108/L密度接种细胞于75mL塑料培养瓶中。接种48h后换液，以后每2～3d换液，观察细胞增殖能力及形态学特征（倒置显微镜）。另将原代培养的MSC接种于盖玻片上，待细胞长出后，用PBS离心洗涤（1000r/min，5min）2次，把细胞片浸入950mL/L乙醇中固定。将已经固定的细胞玻片放入盖片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。滴加滴度为1∶32～64的特异性抗体(一抗，CD29，CD34，CD45，K12)，置于湿盒内，37℃保温孵育60min，另以PBS代替一抗

7、作阴性对照。随后PBS振洗3次，吹干。滴加适当稀释的荧光素标记抗体（二抗，FITC标记的山羊抗兔IgG），置于湿盒内，37℃保温30min。PBS振洗2次，然后用蒸馏水振洗1次。500mL/L缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察并照相记录。1.2.2角膜基质细胞的制备无菌条件下摘取大鼠眼球，沿角膜缘处分离出整个角膜，先用普通消化液浸泡，置于37℃30min，再用dispaseⅡ于37℃消化2～3h。消化后用PBS洗去消化下来的上皮细胞。在显微镜下观察，若发现细胞未消化干净，用眼科小镊子轻轻刮取细胞，

8、确保角膜上皮细胞完全被消化下来。将角膜基质剪成1mm×1mm大小的组织块，放入离心管中加入4mL胶原酶，将离心管倾斜放入37℃孵箱内，每隔5min振摇一次，消化1h。收集消化液，过100目不锈钢网过滤，800r/min离心，5min，去除上清，用PBS离心漂洗1～2次，去除上清，按1×107/L密度接种于25mL培养瓶中。1.2.3大鼠骨髓MSC与角膜基质细胞共培养按Millipore公司的说明，用Trans）装置进行大鼠骨髓间充质干细胞与角膜基质细胞的共培养。共培养体系中上、下层的细胞被隔开，