人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究

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1、人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究【摘要】目的：研究人骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）在体外培养过程中的增殖和成软骨分化现象和规律。方法：以密度梯度离心法分离健康成人髂骨MSCs，观察体外培养过程中细胞形态、生长和增殖现象。取第三代细胞给予地塞米松，维生素C和不同剂量转化生长因子β1（transforminggrowthfactorβ1,TGF-β1）行成软骨细胞诱导。3周后行阿利新蓝及甲苯胺蓝染色蛋白多糖，免疫荧光检测II型胶原，阿利新蓝比色法检测葡萄糖氨基聚糖。结果：体外培养条

2、件下MSCs生长旺盛。在TGF-β1作用下MSCs向软骨骨细胞分化，TGF-β110μg/L组软骨细胞标志物表达最强。结论：MSCs有旺盛的增殖能力。MSCs在一定诱导条件下可以向软骨细胞分化，转化生长因子β1（TGF-β1）是诱导MSCs向软骨分化的关键性因素，10μg/L是其最佳诱导剂量。【关键词】骨髓间充质干细胞;成软骨;转化生长因子β1　　［Abstract］Objective:Toresearchthephenomenonandruleofmultiplicationandchondrogenesisofmes

3、enchymalstemcells(MSCs)derivedfromhumanbonemarrowinvitro.Methods：Healthyadult′sMSCswereisolatedfromIliumandpurifiedbydensitygradient.Toobservetheconformation,growthandmultiplicationofMSCsculturedinvitro.Wechosethepassage143MSCsandinducedthemintochondrogenicdiffer

4、entiationwithDexamethasone，VitaminCandTGF-β1indifferentdosageformedchondracytesinduction.After3weeks,wemeasuredthesulfateglycosaminoglycanwithtoluidineblueandalcianblue,typeⅡcollagenwithimmunofluorescenceandglycosaminoglycanwithalcianbluecolorimetry.Results：MSCsc

5、anbeculturedwellinvitro.MSCswereinducedintochondrocytesbyTGF-β1andTGF-β110μg/Lgrouphadthemostevidentexpression.Conclusion：MSCshavestrongabilityofmultiplicationandcouldbeinducedintochondrocytesundercertaincircumstances.TGF-β1isthemajorfactorofchondrogenesiswhile10

6、μg/Listhebestinducingdosage.　　［Keywords］mesenchymalstemcells;chondrogenesis;TGF-β1　　各种由创伤和疾病引起的关节软骨缺损在临床上十分常见,目前临床上尚无有效的治疗方法。近年来组织工程技术的发展给修复关节软骨缺损带来了希望。最近的比较研究证实骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs)是修复全层软骨缺损的最佳细胞源［1］。笔者采集健康人骨髓，以密度梯度离心法分离人MSCs，行体外培养扩增及成软骨诱导，希望为临床治疗软

7、骨缺损提供参考。14　　1材料与方法　　1.1对象　　骨髓标本取自3名健康成年男性自愿者（28，34，37岁）髂后上棘。3人均无全身性疾病和代谢性疾病。取得知情同意后，无菌条件下抽取骨髓5ml置于抗凝环境。　　1.2主要试剂　　L-DMEM培养基（Gibco公司），类标准胎牛血清（民海生物公司），转化生长因子（TGF）-β1（美国Peprotech公司），维生素C、地塞米松、胰蛋白酶、硫酸软骨素（Sigma公司），人淋巴细胞分离液Ficoll（天津灏洋生物公司），兔抗人二型胶原多克隆抗体、浓缩型Cy3-SABC免疫荧光试

8、剂盒（博士德公司）。　　1.3人MSCs的分离和体外培养　　取2.5ml骨髓加入等量PBS稀释，吹打混匀，贴壁缓慢加入已有5mlFicoll分离液的离心管。2000r/min离心20min，吸取界面云雾状白膜层（富含MSCss）。加入PBS,800r/min离心1014min洗涤2遍，计数。以5×106/cm2接种于