人骨髓间充质干细胞体外培养的实验研究

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1、人骨髓间充质干细胞体外培养的实验研究冯永洪1李培1查振刚2吴昊2李真1黄国彪1刘景峰1(1东莞市中医院广东东莞523005;2暨南大学附属第一医院广东东莞523005)【摘要】目的探讨人骨髓间充质干细胞体外培养的可靠方法。方法采用人手术切下的骨头标木，运用全骨髓贴壁法分离培养hBMSCs;观察并绘制生长曲线；取生长状态良好的第四代细胞，通过形态学、流式细胞仪检测表面标志物等鉴定hBMSCs；诱导hBMSCs分化为成脂肪细胞，鉴定木实验所分离的hBMSCs是否其有多向分化能力。结果第四代细胞CD29和CD44阳性表达率分别为100%和99.8%,CD3

2、1和CD45阳性表达率分别为0.8%和0.4%。流式细胞仪检测证明木研究分离培养hBMSCs的方法可以获得高纯度的间充质干细胞。hBMSCs体外诱导向脂肪细胞分化16d后，镜下可见胞浆内充满圆形脂滴，油红O染色阳性，诱导成脂肪细胞分化率为85.1±3.2%，证实木实验分离的hBMSCs具有多向分化能力。结论采用手术切下的骨性关节炎标木，运用全骨髓贴壁法可获得稳定、均质性良好的hBMSCs,并具有多向分化能力。木方法能为临床上分离、培养人骨髓间充质干细胞提供了另一种可靠的路线。【关键词】人骨髓间充质干细胞体外培养分化近几十年来，随着骨髓间

3、充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)的发现［1］，以及BMSCs具有多向分化能力，如分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、内皮细胞［2-5］,让人们看到了利用BMSCs诱导分化为骨细胞，从而为治疗骨质疏松症和骨折提供新思路。而如何获得有效的、体外培养的人骨髓间充质干细胞是个值得进一步研宄的问题。笔者利用行人工关节置换术中切取出来的骨头标木，经过实验方法能很好地分离、培养和鉴定骨髓间充质干细胞，现报告如下：1材料和方法1.1实验标本来源本实验标本由东莞市中医院和暨南大学附属第一医院提供。所奋标本均

4、取自因骨性关节炎需行全髋关节置换或膝关节表面置换术的患者。同吋排除患冇其他疾病包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、骨肿瘤、甲状腺和甲状旁腺疾病以及肾功能不全的患者。1.2主要试剂与仪器L-DMEM（DMEM-低糖培养基）、胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA、人淋巴细胞分离液、磷酸盐缓冲盐水、青霉素/链霉素双抗、CD31、CD45、CD29、CD44小鼠抗人流式抗体、FITC标记人鼠抗小鼠二抗、IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）、胰岛素和吲哚美辛；汕红0、离心管、培养皿和96孔培养板、倒置相差显微镜、C02培养箱、离心机、Beckma

5、nCoulter流式细胞仪器、超挣工作台、恒温水箱和气浴恒温振荡器。1.3人骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增：在无菌条件下取髋关节或膝关节处骨髓2ml置于15ml离心试管中，随后运用全骨髓贴壁法分离培养hBMSCSo具体实验过程按相关实验操作规范进行（略）。1.4人骨髓间充质干细胞的形态观察：定期应用倒置相差显微镜观察所培养的细胞形态。1.5人骨髓间充质干细胞的生长曲线测定：取1、4、8代人骨髓间充质干细胞，以l×104/ml接种于24孔板内，每天定时收集细胞并用台盼蓝杞染法计算活细胞数，绘制细胞生长曲线。1.6流式细胞仪人骨髓间充质干

6、细胞表面标志物的鉴定：取第4代生长良好80〜90%汇聚的人骨髓间充质干细胞，经0.125%胰酶/EDTA消化，800rpm离心lOmin后，用PBS调节细胞密度为l×106/ml后，然后向细胞悬液中分别滴加小鼠抗人CD31、CD45、CD44、CD29抗体（以PBS代替一抗作为阴性对照）10μl,4°C孵育45min,800rpm离心lOmin后弃去上清，用预冷的PBS洗涤两次后，再滴加FITC标志的人鼠抗小鼠IgG为二抗，4°C避光反应45min,细胞离心洗涤后悬浮于PBS中以备流式细胞仪分析。1.7人骨髓间充质干细胞体外诱导向脂

7、肪细胞分化：第4代细胞经消化、离心、重悬后，将细胞密度调为6×104/ml,然后将lml细胞悬液置于200mm2细胞培养皿中，待细胞完全贴壁后，将普通细胞培养液换为成脂肪细胞诱导分化液。先将实验的培养液换成诱导剂A（L-DMEM+10%FBS+500μmol/LIBMX+lμmol/L吲哚美辛），2d后将培养液换成诱导剂B（DMEM+10%FBS+10μg/ml胰岛素），过Id后，再换成诱导剂A。即成脂诱导剂A2d+成脂诱导剂Bid为一个诱导循环，这种诱导循环重复5次。接种16d后用油红0染色。油红0染色:细胞爬片用PB

8、S冲冼3次，用预冷的10%甲醛固定lOmin，60%异丙醇冲洗，蒸馏水冲洗，汕红0染液室温染色30min，7