滑膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分化潜能的体外研究

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1、中文摘要干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，可作为种子细胞应用于组织工程的研究中。骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）往往应用于骨组织的修复实验中，而滑膜间充质干细胞（synovium-derivedmesenchymalstemcells，SMSCs）近些年来也被广泛研究，作为干细胞家族的新成员，以其高度的成软骨分化能力成为软骨缺损修复的热点。因此,探讨如何利用两种干细胞的分化潜

2、能在组织工程中发挥最优作用具有重要的临床意义。实验目的：体外分离BMSCs和SMSCs，进行成骨和成软骨诱导，通过染色的方法验证SMSCs的多向分化能力，并且通过PCR定量分析BMSCs和SMSCs的成骨和成软骨基因的表达水平，比较二者成骨和成软骨分化能力的强弱，为组织工程中种子细胞的选择提供依据。实验方法：本实验取新西兰白兔，4周龄，雌雄不限，均重约为1Kg，分离兔股骨，采取全骨髓培养法在体外提取BMSCs，分离膝关节滑膜组织，应用酶消化法提取SMSCs，进行贴壁培养。在传代培养过程中观察BMSCs和

3、SMSCs的细胞形态及生长速度。实验均采用第3代干细胞，分为成骨诱导组和成软骨诱导组。成骨诱导为6孔板平面诱导，加入成骨诱导液（地塞米松、抗坏血酸盐、β-甘油磷酸钠、胎牛血清、基础培养液）诱导14天。成软骨诱导为微球诱导，先制作干细胞微球，培养液培养3天后换成软骨诱导液（地塞米松、ITS、羟基脯氨酸、TGF-β3、抗坏血酸盐、基础培养液），诱导14天。SMSCs进行成脂诱导（吲哚美辛、异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、ITS、FBS、基础培养液）7天。诱导完成后，进行茜素红染色检测成骨分化，油红O染色检

4、测成脂分化，阿利新蓝染色和免疫组化染色检测成软骨分化，并进行RT-PCR对成骨和成软骨相关基因的表达水平进行检测，进行统计学分析，比较BMSCs和SMSCs的成骨和成软骨能力。I实验结果：1.原代BMSCs为梭形或多边形，呈“漩涡样”排列，起初生长速度较慢，7天左右达到80%融合；原代SMSCs呈梭形，更类似于纤维形态，排列密集，并呈“鱼群样”排列，生长速度快，5天左右可达80%融合，可传代至第10代，仍未见明显细胞衰老表现，传代培养过程中细胞生长速度和传代速度明显大于BMSCs。2.在茜素红染色结果中

5、，SMSCs成骨分化组可见红色钙结节晶体，SMSCs成软骨分化组通过免疫组化染色可证明有Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和糖胺聚糖存在。另外，油红O染色结果中可以观察到SMSCs成脂分化组有脂滴沉积。以上结果证明SMSCs具有多向分化潜能。3.通过RT-PCR检测两种干细胞成骨和成软骨相关基因的表达水平，结果发现BMSCs成骨组的Ⅰ型胶原、骨钙素和Runx-2的表达水平高于SMSCs成骨分化组（P＜0.05），而SMSCs的Ⅱ型胶原和Sox-9表达水平要高于BMSCs成软骨分化组（P＜0.05），二者Ⅹ型胶原的表达没

6、有统计学差异。实验结论：1.SMSCs自我更新能力强，具有成骨、成脂、成软骨分化的能力，表现出了干细胞典型的生物学特性。2.SMSCs的成软骨分化能力强于BMSCs，相反，BMSCs成骨分化能力要强于SMSCs，因此在组织工程中，软骨组织缺损修复可首选SMSCs作为种子细胞，骨组织缺损修复可首选BMSCs。3.本文系统地比较了BMSCs和SMSCs在组织工程应用中最常见的成骨和成软骨分化能力，为今后组织工程中定向分化的种子细胞的选择提供了一定的理论依据。关键词：滑膜间充质干细胞，骨髓间充质干细胞，成骨，

7、成软骨，组织工程，种子细胞IIAbstractMesenchymalstemcellsareappliedintissueengineeringasseedcellsduetotheself-renewalcapacityandtheabilitytodifferentiateintomesenchymallineagesincludingbone，cartilage，fat，muscleandnerve.Bonemarrowmesenchymalstemcellshavebeenconsideredt

8、obetheprogenitorcellsforbonetissueengineering,andsynovium-derivedmesenchymalstemcells,asanewmemberofthefamilyofstemcells,havebeendescribedaspromisingseedcellsowingtothegreaterchondrogenicpotential.Hence,itisofimportantclin