滑膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分化潜能的体外研究

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中文摘要干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，可作为种子细胞应用于组织工程的研究中。骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）往往应用于骨组织的修复实验中，而滑膜间充质干细胞（synovium-derivedmesenchymalstemcells，SMSCs）近些年来也被广泛研究，作为干细胞家族的新成员，以其高度的成软骨分化能力成为软骨缺损修复的热点。因此,探讨如何利用两种干细胞的分化潜能在组织工程中发挥最优作用具有重要的临床意义。实验目的：体外分离BMSCs和SMSCs，进行成骨和成软骨诱导，通过染色的方法验证SMSCs的多向分化能力，并且通过PCR定量分析BMSCs和SMSCs的成骨和成软骨基因的表达水平，比较二者成骨和成软骨分化能力的强弱，为组织工程中种子细胞的选择提供依据。实验方法：本实验取新西兰白兔，4周龄，雌雄不限，均重约为1Kg，分离兔股骨，采取全骨髓培养法在体外提取BMSCs，分离膝关节滑膜组织，应用酶消化法提取SMSCs，进行贴壁培养。在传代培养过程中观察BMSCs和SMSCs的细胞形态及生长速度。实验均采用第3代干细胞，分为成骨诱导组和成软骨诱导组。成骨诱导为6孔板平面诱导，加入成骨诱导液（地塞米松、抗坏血酸盐、β-甘油磷酸钠、胎牛血清、基础培养液）诱导14天。成软骨诱导为微球诱导，先制作干细胞微球，培养液培养3天后换成软骨诱导液（地塞米松、ITS、羟基脯氨酸、TGF-β3、抗坏血酸盐、基础培养液），诱导14天。SMSCs进行成脂诱导（吲哚美辛、异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、ITS、FBS、基础培养液）7天。诱导完成后，进行茜素红染色检测成骨分化，油红O染色检测成脂分化，阿利新蓝染色和免疫组化染色检测成软骨分化，并进行RT-PCR对成骨和成软骨相关基因的表达水平进行检测，进行统计学分析，比较BMSCs和SMSCs的成骨和成软骨能力。I 实验结果：1.原代BMSCs为梭形或多边形，呈“漩涡样”排列，起初生长速度较慢，7天左右达到80%融合；原代SMSCs呈梭形，更类似于纤维形态，排列密集，并呈“鱼群样”排列，生长速度快，5天左右可达80%融合，可传代至第10代，仍未见明显细胞衰老表现，传代培养过程中细胞生长速度和传代速度明显大于BMSCs。2.在茜素红染色结果中，SMSCs成骨分化组可见红色钙结节晶体，SMSCs成软骨分化组通过免疫组化染色可证明有Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和糖胺聚糖存在。另外，油红O染色结果中可以观察到SMSCs成脂分化组有脂滴沉积。以上结果证明SMSCs具有多向分化潜能。3.通过RT-PCR检测两种干细胞成骨和成软骨相关基因的表达水平，结果发现BMSCs成骨组的Ⅰ型胶原、骨钙素和Runx-2的表达水平高于SMSCs成骨分化组（P＜0.05），而SMSCs的Ⅱ型胶原和Sox-9表达水平要高于BMSCs成软骨分化组（P＜0.05），二者Ⅹ型胶原的表达没有统计学差异。实验结论：1.SMSCs自我更新能力强，具有成骨、成脂、成软骨分化的能力，表现出了干细胞典型的生物学特性。2.SMSCs的成软骨分化能力强于BMSCs，相反，BMSCs成骨分化能力要强于SMSCs，因此在组织工程中，软骨组织缺损修复可首选SMSCs作为种子细胞，骨组织缺损修复可首选BMSCs。3.本文系统地比较了BMSCs和SMSCs在组织工程应用中最常见的成骨和成软骨分化能力，为今后组织工程中定向分化的种子细胞的选择提供了一定的理论依据。关键词：滑膜间充质干细胞，骨髓间充质干细胞，成骨，成软骨，组织工程，种子细胞II AbstractMesenchymalstemcellsareappliedintissueengineeringasseedcellsduetotheself-renewalcapacityandtheabilitytodifferentiateintomesenchymallineagesincludingbone，cartilage，fat，muscleandnerve.Bonemarrowmesenchymalstemcellshavebeenconsideredtobetheprogenitorcellsforbonetissueengineering,andsynovium-derivedmesenchymalstemcells,asanewmemberofthefamilyofstemcells,havebeendescribedaspromisingseedcellsowingtothegreaterchondrogenicpotential.Hence,itisofimportantclinicalsignificancetoexplorehowtoutilizethedifferentiationpotentialofthesetwocelltypesintissueengineeringefficiently.Objective:BMSCsandSMSCswereisolatedandtheirosteogenesisandchondrogenesisassaywereperformed.ThemultilineagepotentialofSMSCswasverifiedbycellstaining.Theirosteogenicandchondrogenicabilitywascomparedbyquantitativeanalysisofthegeneexpressionlevelwithreal-timePCR,inordertodeterminethefavorableseedingcellsforboneorcartilageregenerationrespectively.Methods:ThewholebonemarrowadherentculturemethodwascarriedouttoisolateBMSCs.RandombiopsieswereisolatedfromthekneejointsofNewZealandwhiterabbit,andSMSCswereobtainedbyenzymedigestion.Cellularmorphologyandgrowthratewereobservedintheprocessofcultureinmonolayer.Atpassage3,osteogenesis，adipogenesisandchondrogenesisassaywereperformed.MSCswereculturedinDMEMasnegativecontrol.Afterinducingcompletedalizarinredstaining,oilredOstaining,alcianbluestainingandImmunohistochemistrywerecarriedout.Ontheotherhand,geneexpressionlevelwastestedtocomparetheosteogenicandchondrogenicabilityofMSCsfromtworesourcesbyRT-PCR.Results:1.TheprimaryBMSCsmorphologyperformedspindleshapedorpolygonalandcellswerearrangedserried.Thegrowthratewasoriginallyslow,however,cellsreached80%confluenceatday7.AstoSMSCs,theprimarycellsappearedtobefibroblast-likecells,arrangedserriedandhadagreatergrowthrate,atday5cellsreached80%confluence.2.TheosteogenesisandadipogenesiswereobservedafterIII cellstaining.Besides,collagenⅡ,CollagenⅩandGAGweredetectedbyimmunohistochemicalstaining.3.Theexpressionofosteogeneticgenes(collagenⅠ,osteocalcinandRunx-2)inBMSCswassignificantlyhigherthanthatinSMSCs(P＜0.05),however,theexpressionofchondrogeneticgenes(collagenⅡ,Sox-9)wassignificantlyupregulatedinSMSCscomparedwiththatinBMSCs(P＜0.05).CollagenⅩintwogroupshadnostatisticallysignificantdifferences.Conclusion:1.SMSCspossesstypicalbiologicalcharacteristicsofMSCsincludinghighself-renewalabilityandthecapacityofdifferentiatingintomesenchymallineagesincludingbone，cartilageandfat.2.SMSCshaveagreaterchondrongeneticpotentialthanBMSCs.Onthecontrary,BMSCshaveagreaterosteogeneticcapacitythanSMSCs.Therefore,SMSCscouldbetheoptimalseedcellforcartilageregenerationandBMSCsperformbetterinboneengineering.3.ThisarticlecomparedtheosteogeneticandchondrongeneticabilitywhichareappliedintissueengineeringofBMSCsandSMSCsandtheresultsprovidetheoreticalcriterionfortheselectionofseedcellsintissueengineering.Keywords:SMSCs,BMSCs,osteogenesis,chondrogenesis,tissueengineering,seedcellIV 目录第1章引言.........................................................................................11.1骨髓间充质干细胞的研究现状....................................................11.2滑膜间充质干细胞的研究现状....................................................21.3研究目标.........................................................................................3第2章正文.........................................................................................42.1实验材料.........................................................................................42.1.1实验对象..................................................................................42.1.2实验设备..................................................................................42.1.3实验试剂..................................................................................52.1.4实验试剂的配制......................................................................62.2实验方法.........................................................................................72.2.1兔来源滑膜间充质干细胞的分离和培养..............................72.2.2兔来源骨髓间充质干细胞的分离和培养..............................82.2.3兔SMSCs与BMSCs生长速度对比.....................................82.2.4兔SMSCs与BMSCs的多向诱导分化.................................92.2.5兔SMSCs诱导分化结果染色................................................92.2.6兔SMSCs与BMSCs诱导分化结果的基因水平检测.......102.2.7数据处理................................................................................12第3章实验结果与分析......................................................................133.1干细胞形态特点和生长速度......................................................133.1.1BMSCs形态学特点...............................................................133.1.2SMSCs形态学特点...............................................................133.1.3SMSCs和BMSCs生长速度对比........................................143.2干细胞诱导分化染色结果..........................................................14V 3.2.1成骨诱导染色结果................................................................143.2.2成脂诱导染色结果................................................................143.2.3成软骨诱导染色结果............................................................153.3干细胞诱导分化基因表达结果..................................................163.3.1成骨基因检测........................................................................163.3.2成软骨基因检测....................................................................17第4章讨论.......................................................................................19第5章结论.......................................................................................23参考文献...................................................................................................24作者简介...................................................................................................28致谢.......................................................................................................29VI 英文缩略词缩略词表SMSCssynovium-derivedmesenchymalstemcells滑膜间充质干细胞BMSCsbonemarrowmesenchymalstemcells骨髓间充质干细胞TMDtemporomandibulardisorders颞下颌关节紊乱综合征MSCsmesenchymalstemcells干细胞ALPalkalinephosphatase碱性磷酸酶PBSphosphatebufferedsaline磷酸液缓冲液HBSSHank'sBalancedSaltSolutionHank's平衡盐溶液DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM培养基EDTAethylenediaminetetra-aceticacid乙二氨四乙酸ECMextracellularmatrix细胞外基质ITSInsulin-Transferrin-Selenium-GSupplement胰岛素‐转铁蛋白‐硒添加剂TGF‐βtransforminggrowthfactorβ转化生长因子βFBSfetalbovineserum胎牛血清IBMX3-Isobutyl-1-Methylxanthine3‐异丁基‐1‐甲基黄嘌呤RT‐PCRReversetranscriptionpholymerasereaction聚合酶链式反应GAPDHglyceraldehydephosphatedehydrogenase磷酸甘油脱氢酶COL‐ⅠcollagentypeⅠI型胶原OCNosteocalcin骨钙素Runx‐2run-relatedtranscriptionfactor2COL‐ⅡcollagentypeⅡⅡ型胶原COL‐ⅩcollagentypeⅩⅩ型胶原Sox‐9SRYboxgene-9Rpmroundperminute转/分DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜VII 第1章引言在口腔颌面部疾病中，颌骨缺损和颞下颌关节紊乱综合征（TMD）是两种比较常见而且治疗难度大的疾病。颌骨缺损往往是由肿瘤、创伤、感染、骨髓炎和各种先天性疾病引起。以关节盘移位为特征的TMD随着病程的进展会导致关节盘及关节软骨的破坏及炎症。颌骨缺损的治疗方法主要集中在骨移植和人工骨两方面，但骨移植在骨需求量方面往往达不到要求，需要额外取骨手术部位，而且同种异体骨移植在移植骨愈合方面预后较差，还可能会造成血液疾病传播，人工骨的治疗方法在组织相容性方面也存在着一些不足。目前对于重症TMD的治疗方法，主要有药物介入治疗及外科手术治疗两种方法。药物治疗无法根除TMD的病因，因此只是缓解局部症状；常用的手术治疗方法如自体软骨移植、关节盘复位固定术及关节盘穿孔修补术也存在供体细胞不足及长期疗效不确定等种种不足。正是由于常规治疗方法的弊端难以消除，近些年来，越来越多的人将视线转移到组织工程修复骨缺损和软骨缺损上来。组织工程是通过种子细胞，生长因子和支架材料三者的结合，研究出具有生物活性的组织器官，来修复人体各种组织、器官缺损。目前，科学界已经公认干细胞（MSCs）在适宜条件下，具有成骨，成软骨和成脂肪分化的能力，能够修复动物的组织和器官缺损,且干细胞可从多种组织中提取出来[1]。1.1骨髓间充质干细胞的研究现状MSCs具有高度的增殖更新能力以及分化潜能，能够分化为骨，软骨和脂肪等组织。Pittenger[2]等人系统地描述了人骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有很强的增殖效率，并且具有多向分化潜能，在适宜的体外条件下，能够分化为骨，软骨，脂肪和神经等组织，为多种组织修复过程中种子细胞的选择提供了新的思路。之后，在BMSCs成骨方向，学者们进行了大量的研究[3-5]，结果表明在地塞米松，抗坏血酸，β-甘油磷酸钠的作用下，BMSCs能够向成骨细胞分化，能够检测到钙盐沉积和钙化结节，从而证明BMSCs具有良好的成骨分化能力。此外，骨形1 成蛋白等生长因子也能够促进BMSCs的成骨能力[6]。而近些年来，随着组织工程研究需求增加，传统的培养方法已经不能满足实验需求，越来越多的学者将视线转移到支架材料上来。支架材料能够为干细胞提供适宜的三维环境，该环境模仿体内微环境，能够为干细胞增殖分化提供特异信号，诱导干细胞分化为特定的组织和器官。Liu等人[7]将骨髓间充质干细胞制作成膜片，铺在特殊煅烧处理过牛骨材料上，为干细胞提供三维生长环境，移植到骨缺损大鼠模型中，结果表明这种三维培养模式，不论在体内还是体外，都表现出了良好的成骨分化能力，相比于其他组，该组形成了更多的细胞外基质（ECM），更大的矿化区域和更强的碱性磷酸酶（ALP）活性，由此证明三维支架材料在MSCs定向分化过程中起到了重要的作用。BMSCs具有多向分化潜能，因此也被应用于成软骨和成脂肪的研究中。Mastrogiacomo学者[8]证明在生长因子的作用下，BMSCs不仅具有较好的成骨分化能力，而且还具有相似的成软骨分化能力。Ninomiya等人[9]应用罗格列酮诱导人BMSCs成脂分化，结果在8天内就能达到较好的诱导效果，且成脂效率较高，证实了BMSCs具有较好的成脂分化能力。1.2滑膜间充质干细胞的研究现状滑膜组织是一层无血管和基底膜的膜性结构，DeBari等人[10]首次从人体的滑膜中提取出了滑膜间充质干细胞（SMSCs），体外实验证明SMSCs具有成体干细胞特性，并且具有高度的增殖能力，在适宜的条件下能够向骨，软骨和脂肪等组织分化。Zhang等学者[11]通过对人SMSCs进行分析，发现其表面分子存在CD44，CD166，CD105和CD90，其结果和BMSCs类似。而在细胞扩增效率方面，SMSCs相对于BMSCs来说，具有更高的集落形成效率和扩增能力，这样就能满足少量组织即可获得足够干细胞的临床需求，而且SMSCs具有更类似于成纤维细胞的梭形形态[12]。相对于其他成体MSCs而言，SMSCs的成软骨分化能力更为突出[13]，而且在修复软骨缺损模型的实验中达到了较好的效果。PEI学者对SMSCs进行了系列研究，证明其在软骨缺损修复上的可能性，其认为MSCs随着细胞传代失去成体干细胞生物学特性可能与长时间离开体内壁龛环境有关。将SMSCs种植到SMSCs分泌的ECM上，结果发现SMSCs细胞形态变细长，2 恢复梭形形态，而且增殖效率增加，成软骨分化能力也得到了加强[14]。PEI学者又继续加入了缺氧[15]和生长因子[16]两种因素，结果发现低氧，纤维生长因子和ECM三者相结合的处理能使SMSCs的细胞数目和成软骨效果达到最佳。滑膜间充质干细胞不仅因具有高度的成软骨分化能力而应用于组织工程软骨修复中，而且也被广泛应用于成骨等实验研究中。学者发现SMSCs与PLGA/MSH-AL系统相结合，通过不断释放阿仑膦酸钠作用于SMSCs，促进其成骨，通过检测ALP活性，钙盐沉积和免疫组化等方法证明SMCSs具有较强的增殖效率和成骨能力[17]。SMSCs在组织工程中的应用可以促进修复骨骼肌，包括软骨，骨，肌腱，韧带和肌肉等组织，而要修复这些组织往往需要生长因子的诱导和支架材料的支持[18]。1.3研究目标BMSCs的特性及其在组织工程中的应用已被广泛研究，而SMSCs也逐渐成为种子细胞的研究热点，二者都成为修复组织缺损的新的治疗思路。因为MSCs都具有多向分化的能力，那么BMSCs和SMSCs修复骨缺损和软骨缺损的能力是否有差别，是否存在着BMSCs成骨能力比SMSCs强，而SMSCs成软骨能力比BMSCs强？如果存在这样的现象，可能的原因又是什么？这些问题值得我们去研究探讨。3 第2章正文2.1实验材料2.1.1实验对象新西兰白兔，4周龄，雌雄不限，取6只，体重约1Kg，来源于吉林大学动物实验中心，饲养于吉林大学动物实验中心动物房。2.1.2实验设备表2.1实验设备表实验设备品牌产地二氧化碳培养箱日本SANYO恒温水浴箱国产精宏超净工作台日本SANYO离心机德国Eppendorf冷冻离心机德国Eppendorf倒置荧光显微镜日本Olympus立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂超纯水制备系统国产艾科浦数控超声波清洗器国产舒美磁力搅拌器德国IKA冰箱国产海尔鼓风干燥箱国产精宏液氮罐美国CBS基因扩增仪美国酶标仪美国Biotek电子天平美国OHAUS移液器美国Thermo细胞计数器国产求精培养瓶及孔板美国Corning4 2.1.3实验试剂表2.2实验试剂表实验试剂品牌产地胎牛血清美国Gibco双抗美国Invitrogen两性霉素美国InvitrogenPBS缓冲液自配Ⅰ型胶原酶美国InvitrogenHank’s平衡液美国HycloneDMEM低糖培养基美国HycloneDMEM高糖培养基美国Hyclone胰蛋白酶美国InvitrogenEDTA上海Biotech二甲基亚砜北京化工厂双蒸水国产艾科浦异丙醇北京化工厂地塞米松美国Sigma抗坏血酸盐美国Sigmaβ-甘油磷酸钠美国Sigma3-异丁基-1-甲基黄嘌呤美国Sigma吲哚美辛美国SigmaITS美国GibcoL-脯氨酸美国GibcoTGF-β3美国Peprotech茜素红染液自配油红O染色液自配阿利辛蓝染液美国Cyagen基因引物上海生工Trizol试剂美国Invitrogen逆转录试剂盒日本TAKALAPCR试剂盒日本TAKALA5 2.1.4实验试剂的配制（1）干细胞培养液DMEM中加入10%FBS，1%双抗，0.25μg/ml两性霉素，4℃保存。（2）0.2%Ⅰ型胶原酶称量100mgⅠ型胶原酶粉，加入DMEM，再加入10%FBS配成50ml溶液，充分混匀，过滤，分装成50份，-20℃保存。（3）PBS缓冲液取6g成品PBS粉溶于500ml去离子水，充分溶解混匀，调节PH值为7.4，过滤，4℃保存。（4）胰酶称取0.25g胰酶粉，0.02gEDTA，溶于100mlPBS，充分溶解混匀，过滤后4℃保存。（5）细胞冻存液DMEM中加入10%二甲基亚砜，30%FBS，充分混匀，4℃避光保存。（6）成骨诱导液DMEM中加入10mM甘油磷酸钠，50μM抗坏血酸盐，10%FBS，100nM地塞米松，充分溶解混匀，4℃保存。（7）成脂诱导液DMEM中加入100mM吲哚美辛，0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，1μM地塞米松，10μg/mlITS，10%FBS,充分溶解混匀，4℃保存。（8）成软骨诱导液DMEM中加入10ng/mlTGF-β3，40μg/mlL-脯氨酸，10μg/mlITS，100nM地塞米松，0.2mM抗坏血酸盐，4℃保存。（9）油红O染液称取0.5g油红O粉溶于100ml异丙醇，溶解后用棕色瓶密封，4℃保存。（10）茜素红染液称取0.1g茜素红粉溶解于100mlTris-Hcl，调节PH值为8.3，过滤后避光保存于4℃冰箱。6 2.2实验方法2.2.1兔来源滑膜间充质干细胞的分离和培养（1）膝关节滑膜组织的提取：新西兰白兔，4周龄，雌雄不限，取3只，均重约为1Kg，然后在无菌手术室内，将其固定在手术台上，用3%戊巴比妥溶液（1ml/Kg）从耳缘静脉注射。待全麻后，剃除兔四肢膝关节区域毛发，然后用75%酒精消毒。使用外科手术器械于膝关节中线行切口，组织剪逐层分离皮下肌肉组织，切开四头肌，将靠近膝关节的四头肌断端反向牵拉，暴露关节囊、髌骨以及髌骨下韧带，使用眼科剪和眼科镊分离出韧带附近的薄层滑膜组织，约0.5cm×0.5cm样本，迅速放入低温含有双抗的HBSS中，转移到超净台内，并使用HBSS冲洗2遍，分离除去其他杂质。（2）滑膜组织的消化：再用无菌HBSS反复冲洗滑膜组织样本，直到滑膜组织样本清亮透明，不含血液及脂肪结缔组织，使用精细眼科剪将滑膜组织样本剪碎，成1mm×1mm大小，转移到含有0.2%Ⅰ型胶原酶，10%FBS的高糖培养基中，然后置入恒温细胞培养箱，37℃消化过夜。（3）滑膜间充质干细胞的收集：待滑膜组织消化完成后，用无菌的200目滤网过滤。将细胞悬液转移至15ml离心管中，低温下1200rpm离心5min，弃上清，用PBS反复冲洗沉淀，加入含有10%FBS和双抗的DMEM/HighGlucose，2重悬，血细胞计数器计数，转移入25cm培养瓶中，置入含5%CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养。4天后换液，去除未贴壁的细胞。（4）滑膜间充质干细胞的扩增：将滑膜间充质干细胞置于含5%CO2的细胞培养箱中，在37℃下进行单层细胞培养，每3天换液一次，待干细胞达到80%融合时进行细胞传代。将培养瓶转移入超净台，小心弃除培养液，加入PBS冲洗2遍，在室温下加入胰酶，转入培养箱中消化。消化2min后取出培养瓶，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，待细胞形态轻微变圆，立刻将培养瓶转入超净台，加入1.2倍体积培养液终止消化，吹打混匀，离心后重悬，以1:4比例传代。（5）滑膜间充质干细胞的冻存：在第3代干细胞80%-90%融合时，弃除培养液，PBS冲洗3遍，加入0.25%胰酶消化，待细胞轻微变圆后终止消化，低温下1200rpm离心5min，弃上清，重悬，细胞计数器计数，每个冻存管内含有干7 6细胞3×10/ml，离心后用含有10%二甲基亚砜和30%FBS的DMEM重悬，放入梯度冻存盒梯度冻存，后转入液氮中储存。（6）滑膜间充质干细胞的复苏：在液氮罐中迅速取出冻存管，转移至37℃恒温水浴箱内，并且快速摇晃，待冻存液完全溶解后，转移到超净台内，将冻存液转入离心管中，缓慢滴加入10倍体积的培养液，速度由慢到快，避免速度过快导致细胞裂解。离心管以1200rpm离心5min，弃上清，重悬。用细胞计数器242计数，接种于25cm培养瓶内，密度为1×10/cm，充分混匀，置入含5%CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养，隔日换液，去除未贴壁细胞，后每3天换液。2.2.2兔来源骨髓间充质干细胞的分离和培养（1）兔来源骨髓间充质干细胞的体外分离：新西兰白兔，4周龄，雌雄不限，取3只，均重约为1Kg，然后在无菌手术室内，将其固定在手术台上，手术区域用2%利多卡因实施局部麻醉。待麻醉后，在无菌条件下，使用含有0.2ml肝素（3000U/ml）的5ml注射器，从兔髂后上棘处进针，抽取3-5ml骨髓，缓慢加入等量含有10%FBS的低糖培养液，充分混匀，转移至15ml离心管内以800rpm低速离心，在超净台内弃上清，PBS冲洗2遍，培养液重悬，血细胞计数器计数，2转移至25cm培养瓶中，置入含5%CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养。24小时后换液，去除未贴壁的细胞，后每2天换液。（2）兔来源骨髓间充质干细胞的传代：将骨髓间充质干细胞置于含5%CO2的细胞培养箱中，在37℃下进行单层细胞培养，每2天换液，待干细胞达到80%融合时进行细胞传代。将干细胞转移入超净台，轻轻弃掉培养液，使用无菌PBS冲洗2遍，在室温条件下加入胰酶，置入培养箱中消化。消化完成后，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，若细胞形态开始变圆，即可将培养瓶转入超净台，快速用1.2倍体积培养液终止消化，将悬液吹打混匀，1200rpm离心，重悬，以1:3比例传代。第3代骨髓间充质干细胞可进行冻存，使用时进行复苏。2.2.3兔SMSCs与BMSCs生长速度对比取第3代SMSCs和BMSCs，使用CCK-8试剂盒在种板后第1天、第4天和第7天测定吸光度，绘图对比二者生长速度。8 2.2.4兔SMSCs与BMSCs的多向诱导分化（1）干细胞的成骨诱导分化:取第3代SMSCs，胰酶消化后，加入培养液32终止消化，1200rpm离心后重悬，计数器计数，以5×10/cm的密度接种于6孔板，充分混匀，置于含5%CO2的恒温细胞培养箱中，第二天换新鲜培养液，待孔板内干细胞达到80%以上融合时，加入成骨诱导液，每2天换液一次，诱导14天。对照组为相同方法处理的干细胞接种于6孔板内，加入细胞培养液培养14天。同理取第3代BMSCs，行相同处理进行成骨诱导。（2）干细胞的成脂诱导分化：取第3代SMSCs，胰酶消化后，加入培养液32终止消化，1200rpm离心后重悬，计数器计数，以5×10/cm的密度接种于6孔板，充分混匀，置于含5%CO2的恒温细胞培养箱中，第二天换新鲜培养液，待孔板内干细胞100%融合时，加入成脂诱导液，每2天换液一次，诱导7天。对照组为相同方法处理的干细胞接种于6孔板内，加入细胞培养液培养7天。（3）干细胞的成软骨诱导分化a干细胞微球的制作：取第3代SMSCs，胰酶消化后，加入培养液终止消化，1200rpm离心后重悬，细胞计数器计数，调整细胞悬液浓度，转移3ml细胞5悬液入15ml离心管内，保证每个离心管内含有3×10个细胞。然后以1200rpm离心5min，离心完成后可见细胞沉淀成扁平状沉积于离心管底，将离心管瓶盖拧松，轻轻插入无菌试管架，放入培养箱。24h后取出试管架，可见细胞团块收缩，接近于球形，轻弹离心管底，细胞微球脱离管底，再置入培养箱培养。48h时，取出离心管，转入超净台，将干细胞微球轻轻取出，置入24孔板。b干细胞成软骨诱导：将干细胞微球放入24孔板内，弃除培养液，加入成软骨诱导液，每2天换液，诱导14天。对照组为相同方法处理的干细胞微球转移入24孔板内，加入细胞培养液培养14天。同理取第3代BMSCs，进行相同处理进行成软骨诱导。2.2.5兔SMSCs诱导分化结果染色（1）干细胞成骨诱导分化结果染色：取出孔板，弃除诱导液，用PBS冲洗3遍。4%多聚甲醛室温固定15min，固定完成后PBS冲洗3遍，每孔加40mM茜素红染色液1ml，室温染色20min。弃除染色液，PBS漂洗分色，倒置显微镜9 下观察，拍照。（2）干细胞成脂诱导分化结果染色：取出孔板，弃除诱导液，用PBS冲洗3遍。4%多聚甲醛室温固定15min，固定完成后PBS冲洗3遍，加入油红O染色液，室温染色20min。弃除染色液，60%异丙醇漂洗脱色，倒置显微镜下观察，拍照。（3）干细胞成软骨诱导分化结果染色a微球切片的制作：诱导完成后，将微球转移入EP管内，4%多聚甲醛固定过夜，再将微球用梯度酒精脱水，放入二甲苯内透明，浸蜡，包埋。将蜡块制作成4μm厚的切片，在60℃下处理24h，室温干燥。b微球阿利新蓝染色：恒温烤片机上烤片30min后，用梯度酒精将切片脱水脱蜡，水洗切片。用阿利新蓝染液染色20min，水洗固定切片，水洗切片。梯度酒精脱水后用二甲苯透明，封片，镜下观察拍照。2.2.6兔SMSCs与BMSCs诱导分化结果的基因水平检测（1）RNA提取a成骨诱导组①诱导完成后弃除诱导液，并用PBS冲洗孔板②每孔内加入1mlTrizol试剂，室温静置1min③将孔板内液体充分吹打混匀，直到孔板底部清亮，转移入1.5ml无酶EP管中，室温条件下孵育5min。④每个EP管内加入氯仿0.2ml，摇晃15s并在室温内孵育样本3min。⑤12000rpm低温离心15min，可见液体分层。⑥EP管倾斜45°，缓慢吸取上清，将上清转移入新EP管内，再加入0.5ml异丙醇，轻轻吹打液体，直至液体混匀。⑦室温条件下孵育样本10min后，12000rpm低温离心15min，弃上清，保留EP管底部RNA微球，轻轻清洗RNA微球，再用离心机7500rpm低温离心5min，弃上清。⑧超净台内干燥RNA微球后加入DEPC水20μl重悬，转移入60℃恒温水浴箱内处理15min，测定吸光度值。10 b.成软骨诱导组①取出干细胞微球放入含有液氮的无菌研钵内，充分研磨至微球碾碎成粉末，收集微球剩余粉末，再转移入1.5ml无酶EP管内，加入1mlTrizol试剂，吹打混匀。②其余步骤与上述步骤一致。（2）RNA逆转录①按照TAKALA逆转录试剂盒说明书加入OligodTPrimer，dNTPMixture，TotalRNA，用RNaseFreedH2O，在42℃恒温水浴箱中处理2min，放入4℃冰箱保存。②按照TAKALA逆转录试剂盒说明书加入上述反应液，5×PrimeScript®Buffer，RNaseInhibitor，PrimeScript®RTase，RNaseFreedH2O，在PCR仪上按37℃处理15min，85℃处理5s，4℃30min，将逆转录的cDNA在-20℃保存。（3）RT-PCR设计样本分组，并按照PCR试剂盒的说明书，分别加入dH2O，SYBR®PremixExTaq，PCRForwardPrimer，PCRReversePrimer，ROXReferenceDyeII，DNA模板，在吉林大学口腔医院实验中心进行RT-PCR。表2.3基因和引物基因名称引物序列GAPDH‐F5’‐TCACCATCTTCCAGGAGCGA‐3’GAPDH‐R5’‐CACAATGCCGAAGTGGTCGT‐3’Col1A1‐F5’‐GGCAACAGCAGGTTCACTTA ‐3’Col1A1‐R5’‐GGCAAACGAGATGGCTTATT ‐3’OCN‐F5’‐ACAGAGCGACAGCATGAGG ‐3’OCN‐R5’‐TCTTGGACACGAAGGCTGA ‐3’Runx‐2‐F5’‐CCTTCCACTCTCAGTAAGAAGA‐3’Runx‐2‐R5’‐TAAGTAAAGGTGGCTGGATAGT‐3’Col2A1‐F5’‐AAGAGCGGTGACTACTGGATAG‐3’Col2A1‐R5’‐TGCTGTCTCCATAGCTGAAGT‐3’Col10A1‐F5’‐GAAAACCAGGCTATGGAACC ‐3’Col10A1‐R5’‐GCTCCTGTAAGTCCCTGTTGTC ‐3’Sox‐9‐F5’‐CTGGAGACTGCTGAACGAGAG‐3’Sox‐9‐R5’‐CCATTCTTCACCGACTTCCTC‐3’11 2.2.7数据处理所有数据使用origin7.5软件进行绘图，并采用SPSS17.0软件进行统计学分析，所有实验结果采用单因素方差分析和t检验进行统计学分析。图中*表示P小于0.05，具有统计学意义，**表示P小于0.01，具有明显统计学意义，无*表示无统计学意义。12 第3章实验结果与分析3.1干细胞形态特点和生长速度3.1.1BMSCs形态学特点在倒置荧光显微镜下观察，可见原代BMSCs成梭形(见图3.1A)，在原代培养初期生长速度较慢，经过7天培养后达到80%融合，并且呈现“漩涡样”排列（见图3.1B）3.1.2SMSCs形态学特点在倒置荧光显微镜下观察，原代SMSCs成梭形，更类似于纤维样细胞形态（见图3.1C），并呈“鱼群样”生长，排列密集，在培养初期生长速度已较快，在第5天左右可达80%融合（见图3.1D），传代过程纯化了SMSCs，形态趋向于一致，传代培养过程中细胞增殖效率明显高于BMSCs，且传代可到10代，仍无明显形态改变，未观察到细胞衰老迹象。图3.1BMSCs与SMSCs形态学观察13 3.1.3SMSCs和BMSCs生长速度对比对比二者吸光度值可发现SMSCs生长速度比BMSCs快，结果均具有统计学意义。（见图3.2）图3.2SMSCs和BMSCs生长速度对比3.2干细胞诱导分化染色结果3.2.1成骨诱导染色结果SMSCs成骨诱导7天后，镜下可观察到细胞基质内颗粒样物质变多，细胞形态逐渐变为多角形，体积增大，诱导结束后，可发现细胞间出现钙结节(见图3.3A)，对细胞固定，进行茜素红染色，镜下可发现深红色同心圆样晶体，为钙盐沉积（见图3.3B）。对照组进行茜素红染色（见图3.3C）。3.2.2成脂诱导染色结果SMSCs成脂诱导3天后，镜下观察到细胞逐渐变为圆形，体积增大，胞质14 内出现透亮脂滴（见图3.3D），圆形，位于细胞核周围，并且呈“串珠样”排列。诱导7天后，观察到脂滴逐渐变大，部分脂滴融合。行油红O染色，可在镜下观察到橘红色脂滴（见图3.3E），对照组进行油红O染色，镜下观察（见图3.3F）。图3.3SMSCs成骨茜素红、成脂油红O染色3.2.3成软骨诱导染色结果微球诱导14天后，取出微球，PBS冲洗、固定、包埋、切片，进行HE染色（见图3.4A），Ⅱ型胶原免疫组化染色见棕黄色染色区域，为Ⅱ型胶原（见图3.4B），行Ⅹ型胶原免疫组化染色见棕黄色着色区域，为Ⅹ型胶原（见图3.4C）。再行阿利新蓝染色，可见细胞基质和胞外基质呈现为蓝色，细胞核为浅蓝色，证明糖胺聚糖的存在，成软骨发生（见图3.4D）。15 图3.4SMSCs成软骨免疫组化染色染色图3.5中可见诱导完成后SMSCs微球（左）体积明显大于BMSCs微球（右），并且硬度也高于BMSCs微球。+图3.5SMSCs（左）和BMSCs（右）成软骨微球16 3.3干细胞诱导分化基因表达结果3.3.1成骨基因检测通过RT-PCR检测成骨相关基因的表达，结果发现BMSCs成骨组的Ⅰ型胶原表达水平是SMSCs成骨组的15倍（P＜0.01），骨钙素表达水平是SMSCs成骨组的5倍（P＜0.01），Runx-2的表达水平是SMSCs成骨分化组的4倍（P＜0.05），结果具有统计学意义。（见图3.6）图3.6SMSCs和BMSCs成骨基因表达水平3.3.2成软骨基因检测RT-PCR结果显示成软骨相关基因的表达，SMSCs成软骨组的Ⅱ型胶原表达水平是BMSCs成软骨组的2.5倍（P＜0.01），Sox-9表达水平是BMSCs成软骨组的2.5倍（P＜0.05），结果具有统计学意义。而Ⅹ型胶原的表达没有统计学差异。（见图3.7）17 图3.7SMSCs和BMSCs成软骨相关基因表达水平18 第4章讨论SMSCs作为干细胞家族的一员，以其高度的增殖能力及成软骨分化能力成为关节修复中的热门干细胞[19]，为组织工程修复软骨缺损提供了新的研究方向。在本实验中，我们通过染色方法和检测成骨和成软骨相关基因的表达验证了SMSCs的多向分化潜能。有研究[20]表明成骨诱导中，抗坏血酸盐、地塞米松和β-甘油磷酸钠的作用十分明显，本实验采取该诱导方法，发现诱导后，细胞形态变为多角形，体积增大，进行茜素红染色发现深红色同心圆样钙盐晶体，从而验证了SMSCs的成骨分化能力。在成脂诱导后，细胞变圆，体积变大，胞质内出现“串珠样”圆形透亮脂滴，部分脂滴可发生融合，行油红O染色后可见橘红色脂滴形成，从而验证了SMSCs的成脂分化能力。在成软骨诱导后，进行HE染色可见软骨陷窝形成，阿利新蓝染色发现了成软骨特异性标志物糖胺聚糖的存在，而免疫组化染色也证明了Ⅱ型胶原的形成,验证了SMSCs的成软骨分化能力。同时，我们也检测到SMSCs成骨基因Ⅰ型胶原，骨钙素和Runx-2的表达，从基因水平证明了SMSCs的多向分化能力，与前人研究结果一致[21]。干细胞的鉴定最早是根据其细胞自身特点来进行的，最标准的方法是测定集落形成的特点，也就是观察细胞的黏附效率以及梭形细胞可通过增殖形成集落，我们在实验中通过这种方法获得了SMSCs，通过染色方法确定了其多向分化潜能，因此确定SMSCs是一种具有干细胞典型特征的细胞。此外，极小量的滑膜组织样本通过分离培养即可获得足量的SMSCs，本实验也证明SMSCs增殖速度比BMSCs快，从这一点上可以看出SMSCs不但具有高度分化潜能，同时也表现出了出色的增殖效率，因此成为干细胞家族中的重要成员。同时，两种细胞表面的分子表型也通过流式细胞仪进行对比分析，结果发现SMSCs中95%以上的细胞表面CD44，CD90，CD105,CD147均为阳性，而CD45，CD117，CD31为阴性，部分细胞表面可发现CD10，CD54，CD106，CD166,结果与BMSCs表型相似[22]。但是关于SMSCs表型分子的研究结果也存在着一些不同，SMSCs表面可能还存在CD73，CD271等分子[23]。在SMSCs的亚群中，经过和未经过培养的SMSCs中CD271的表达并不一致，而且，健康人来源SMSCs19 的CD34的表达高于骨关节炎患者[24]。因此，SMSCs表面的分子表型可能会随着周围环境条件变化而发生轻微改变，具体机制尚不清楚，有待于进一步研究。SMSCs和BMSCs都具有多向分化潜能且在细胞表型方面也十分相似，然而制作的细胞微球在成软骨诱导后的表现却不同，SMSCs成软骨组的软骨微球体积更大，质地更硬，且湿重也明显大于BMSCs成软骨组的软骨微球，这一结果也表明SMSCs更适合于软骨组织修复。Ⅰ型胶原由成骨细胞分泌，可与其他细胞和基因共同作用，大量胶原累积可形成骨雏形，为矿化做准备，最终能够在多因素共同作用下形成骨组织，而Ⅰ型胶原在成骨诱导8-10天分泌量达到高峰，其分泌量在两周后明显下降[25]，因此本实验采取诱导14天的方法，在Ⅰ型胶原分泌高峰期进行检测，能充分反映其表达水平的高低。在本实验成骨基因检测结果中，我们发现BMSCs成骨诱导组Ⅰ型胶原表达量为SMSCs成骨诱导组的15倍。另一项重要成骨标志骨钙素由成骨细胞分泌合成，具有骨形成代谢的调节作用，保证骨的矿化速率[26]，反映了成骨细胞的成骨活性，标志着成骨细胞的成熟，本实验检测到BMSCs成骨诱导组OCN的表达是SMSCs成骨诱导组的5.5倍。此外，在成骨过程中起重要调节作用的Runx-2是干细胞成骨分化过程中重要的特异性转录因子，它能够调控细胞外基质基因在成骨分化过程中的表达，并且在成骨细胞的成熟过程中发挥重要作用[27]，而本实验检测到BMSCs成骨诱导组Runx-2的表达是SMSCs成骨诱导组的4倍。因此，通过比较三个重要的干细胞分化标志基因的表达水平，可以证明BMSCs比SMSCs的成骨分化能力更强。此结论与Djouad学者的研究结果一致[28]。我们在实验中比较了成软骨分化过程中两种干细胞成软骨特异性基因的表达水平，以此来比较这两种组织来源的干细胞成软骨分化能力的强弱。其中，Ⅱ型胶原主要分布在个体的软骨等组织中，是构成软骨基质的重要成分，并且可以促进软骨细胞分化，Lu学者[29]认为Ⅱ型胶原能够促进脂肪来源干细胞的成软骨能力。而Sox-9是一种在干细胞成软骨分化过程中必不可少的转录因子，在胚胎发生时期就已经在软骨中表达，与Ⅱ型胶原和Ⅺ型胶原表达一致，它能够通过与Ⅱ型胶原基因序列结合来表达来促进成软骨发生，因此Sox-9可作为软骨发生的主要标志[30]。我们在实验结果中发现，SMSCs成软骨诱导组Ⅱ型胶原的表达水平是BMSCs组的2.4倍,Sox-9的表达水平为BMSCs成软骨组的2.5倍，均具有统计20 学意义，这表明了SMSCs在成软骨分化能力方面要强于BMSCs。而Ⅹ型胶原在两种来源干细胞成软骨分化过程中均有表达，且无明显差别，证明二者均有成软骨发生。关于SMSCs和BMSCs的分化能力的比较，有学者进行了相关研究。Futami等学者[12]对鼠来源的SMSCs和BMSCs进行了分化能力的比较，结果发现BMSCs的成骨能力强于SMSCs，而SMSCs的成软骨能力相比BMSCs来说，在成软骨相关基因表达水平上稍强，但是在软骨基质形成方面没有明显差别。而Yusuke学者[31]提取了人来源SMSCs、BMSCs、脂肪、骨膜和骨骼肌来源的间充质干细胞，用染色的方法比较了各种组织来源干细胞的分化能力，结果显示，SMSCs的成软骨能力最强，而BMSCs和SMSCs以及骨膜来源干细胞的成骨能力强于其他干细胞。人来源SMSCs成软骨能力强于BMSCs这一猜想已经逐渐被学者们证实[22]。就目前而言，为何不同组织来源干细胞的分化能力有明显差别还没有合理的解释，但是趋向于“干细胞来源组织局部环境论”的说法。干细胞来源组织的微环境往往会影响干细胞向特定的方向进行分化[32]，滑膜来源的干细胞表现为成软骨能力突出而脂肪组织来源干细胞成脂能力突出[33]，因此我们提出猜想，可能组织局部的微环境中的各种因素例如生长因子，氧气浓度和细胞外基质等可作用于干细胞，诱导干细胞向特定方向分化，从而决定了干细胞某个方向较强的分化能力。因此，为了能够促进干细胞的分化能力，学者们将重点转移到构建模拟干细胞局部壁龛环境上来。干细胞与局部环境中组织和细胞外基质等接触，为干细胞提供三维生长环境,而将细胞外基质作为支架来模拟成体干细胞生长的壁龛环境可以促进干细胞的分化能力[34]。此外，干细胞所处壁龛环境中的氧浓度在干细胞分化过程中也起到非常重要的作用，人体组织中平均氧浓度为2%-9%，局部组织更低[35]，而空气中氧浓度为21%[36]，可见体外诱导分化常不符合体内的实际环境，因此实验中采取低氧处理来模拟体内壁龛环境，研究表明[37-38]低氧条件下，SMSCs的成软骨能力相比常氧得到加强。在体内环境中，生长因子是不可或缺的一大要素。干细胞来源的组织可分泌生长因子，在生长因子作用下，干细胞的分化能力得到加强。在干细胞成软骨分化过程中，加入TGF-β可以促进其分化能力[39]。21 由此可见，干细胞的分化能力与其所处的壁龛环境的关系十分密切，包括三维生长环境、氧浓度、生长因子等因素。也就是说，不同种类干细胞的组织来源不同，所处的微环境不同，其分化能力也不同。而本实验证明了SMSCs成软骨能力高于BMSCs，相反，BMSCs成骨能力强于SMSCs，此结果为今后组织工程中软骨缺损和骨缺损修复中种子细胞的选择提供了参考和理论依据。22 第5章结论1.SMSCs自我更新能力强，具有成骨、成脂、成软骨分化的能力，具有干细胞典型的生物学特性。2.SMSCs的成软骨分化能力高于BMSCs，相反，BMSCs成骨分化能力要高于SMSCs，因此在组织工程中，软骨缺损修复可首选SMSCs作为种子细胞，骨缺损修复可首选BMSCs。3.本文系统地比较了BMSCs和SMSCs在组织工程应用中最常见的成骨和成软骨分化能力，并且得出结论，为今后组织工程中定向分化的种子细胞的选择提供了一定的理论依据。23 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作者简介姓名：袁洋性别：男民族：汉籍贯：安徽省六安市出生日期：1990.10学习经历：2008年09月-2015年06月就读于吉林大学口腔医学院七年制在学期间发表论文：袁洋,王思涵,郭小凯,等.滑膜间充质干细胞的生物学特性及其在软骨组织工程中应用的研究进展[J].海南医学,2015,26(2):214-217.28 致谢时光如梭，七年的大学生活即将结束，在此刻，我的心里充满了激动、期望和不舍，这七年让我学会了许多不曾有的东西，在这里我要向对我给予过帮助和鼓励的老师和同学们表示衷心的感谢，谢谢你们陪伴我走过这一段刻苦铭心的日子。首先，我要感谢我的恩师刘畅副教授，感谢老师在学习和生活中给予我的帮助和指导，在我迷茫的时候给我指引了方向，感谢老师以身作则，以渊博的知识、严谨的工作态度和刻苦钻研的学术作风为我树立了今后的奋斗目标。衷心感谢刘畅老师两年来对我的悉心培养和言传身教，他将是我以后工作和学术的风向标！在此还要感谢正畸科的全体老师和同伴们，感谢胡敏教授、孙新华教授、陈远萍教授、杨陆一副教授、朱宪春副教授、公柏娟副教授，及王芳老师、庄金良老师、候旭老师、孙秀梅老师、侯建华老师、史瑞新老师、于东升老师在我学习期间给我的学术和临床上的指导，感谢毕长青老师、宋英华老师、金娟老师，及张玉、宋美佳、卞良爽、孙珊珊、任静怡等护士在我临床实习期间给予的帮助。另外，还要特别感谢师母吴哲老师在我学习和科研过程中遇到困难的时候，给予我鼓励和关怀，让我在异乡求学时感到倍加温暖。感谢吉林大学口腔医院实验中心孙宏晨老师、张泽兵老师、朱桂彬老师、倪石磊老师，以及吉林大学基础医学院马英智老师在实验过程中给予我的指导和帮助。感谢吉林大学口腔医院申玉琴老师、艾永华老师、魏秀峰老师、刘霞老师、吴健老师、刘红老师、彭铁男老师在我生产实习期间对我的谆谆教诲，令我收益颇丰。感谢师姐刘莹、杨午、赵明璨、王亚斐在学习生活和实验中给我的帮助和鼓励，感谢同门王硕相伴一起共同奋斗，感谢师妹王春晖、贺娇娇、王思涵、师弟郭晓凯在特殊时刻给予我的帮助。感谢吉林大学口腔医学院2008级全体同学，我们共同走过7年的青春，期间有欢笑、泪水，感谢你们给我留下了美好的回忆。29 感谢我的家人和宋晓兵，感谢你们在我沮丧难过时的相伴，感谢你们对我的信任和鼓励，感谢你们对我生活中点点滴滴的关怀，感谢你们用最无私的爱陪我一路走下去！感谢各位参与我论文评审和答辩工作的各位专家和老师！感谢我的母校吉林大学，衷心祝愿母校能够迎来更加辉煌的明天！30