人骨髓间充质干细胞的分离与培养

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1、原创性声明本人声明:所呈交的硕士学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名:女”·61:})日期:o2,-4;年了月11,日关于论文使用授权的说明本人同意学校有权保留并向国家有关部门送交学位论文的复印件，允许论文被查阅和借阅。不同意学校及国家有关机构有权公布论文的全部或部分内容，并采用影印、缩印或其他复制手段

2、保存论文。论文作者签“:’右券侮指导教师签“:日期:伽}}‘华日期:v}9}}石`了提目的:建立有效分离和简便鉴定骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法，并观测不同条件对骨髓间充质干细胞生长的影响，为更进一步研究骨髓间充质干细胞的生物学特性提供理论基础和实验手段。方法:用密度为1.073g/ml的percoll从骨髓血中分离单个核细胞，利用贴壁筛选的原理，在含10%胎牛血清的DMEM培养条件下，对获得的同源细胞群进行免疫细胞化学、电镜和流式细胞仪检测;并在培养基中加入成骨添加剂，观察细胞的成骨潜能;同时观察高糖和低糖培养基以及纤维连接素对间

3、充质干细胞生长的影响。结果:利用percoll分离和贴壁筛选获得的骨髓间充质千细胞，是均一的同源细胞群，表达整合素CD29,翁附分子CD44和Flk-1;不表达CD34,CD45等造血细胞、白细胞相关抗原。成骨诱导后，骨髓间充质干细胞出现钙盐沉积。高糖和低糖DMEM对原代骨髓间充质干细胞生长的影响无明显差别，但可影响传代细胞的生长有影响。纤维连接素影响MSCs贴壁和增殖。结论:percoll梯度离心和贴壁筛选是获得骨髓间充质干细胞的有效方法;免疫细胞化学方法、电镜、流式细胞仪及反向成骨诱导方法的联合应用能够准确鉴定MSCs。低糖DMEM

4、是MSCs培养和扩增的适宜培养基。纤维连接素影响MSCs的生长特性，促进MSCs的贴壁和增殖。人骨髓间充质干细胞的分离与培养前言干细胞具有无限的自我更新能力，并可分化产生至少一种高度分化的子代细胞。干细胞始终存在于人体内，包括处于发育早期的胚胎干细胞和存在于成年人体内的成体干细胞。胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES)是指从囊胚内细胞团或桑堪胚经体外抑制分化培养分离的多能性细胞，具有发育的全能性，在一定条件下能够向三个胚层的组织和细胞分化。目前，人的胚胎干细胞已从发育早期的囊胚期内细胞团和原始生殖细胞中分离，并分别建系

5、成功。这将给移植治疗、药物开发及筛选、细胞及基因治疗和生物发育的基础研究等带来深远的影响，同时打开了在体外生产所有类型的可供移植治疗的人体细胞、组织乃至器官的大门。但是，由于胚胎干细胞异体移植的免疫排斥问题以及其所涉及的法律和伦理道德问题，极大地制约了对它的研究和应用。成体组织干细胞是指从胚胎、胎儿及成年个体各种组织中分离出的多能性干细胞。机体内几乎所有的组织都包含有干细胞，各种干细胞不仅可以纵向分化，而且还可以横向分化，具有很强的实用性.目前，最常用、研究最为深入且最具有临床应用潜力的成体干细胞是骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞(m

6、esenchymalstemcells,MSCS)是一种具有多向分化潜能的干细胞，它可以向多种结缔组织及部分来源于外胚层的组织分化，形成骨、软骨、骨骼肌、肌健、韧带、真皮、脂肪、骨髓基质和神经等1.21。利用它进行组织工程学研究有如下优势:①取材方便且对机体无害，间充质千细胞可取自自体骨髓，简单的骨髓穿刺即可获得;②由于间充质干细胞取自自体，由它诱导而来的组织进行移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题;③由间充质干细胞分化的组织类型广泛，理论上讲它能分化为所有的间充质组人骨曲间充质干细胞的分离与培养织类型:将它分化为骨、软骨或肌肉、肌健在

7、创伤性疾病中具有应用价值;将它分化为心肌组织则有可能构建人工心脏，在心脏病中有应用价值;将它分化为真皮组织则在烧伤中有不可限量的应用前景。因骨髓间充质干细胞的多向分化潜能和强大的增殖能力，以及其易于从骨髓中分离及体外扩增纯化，所以近年来在组织工程领域倍受重视，得到广泛研究。然而，目前分离纯化及体外培养骨髓间充质干细胞的方法尚无一致方案，有些方法相当繁琐。尤其因为MSCs缺乏特异性的表面标记，对如何鉴定MSCs存在着不同的意见和看法.本研究的目的是建立有效分离和简便鉴定骨髓间充质干细胞的方法，并观测不同条件对其生长的影响。我们联合应用密度

8、梯度离心和贴壁筛选的方法从骨髓中分离间充质干细胞。通过免疫细胞化学、电镜及流式细胞仪对其加以鉴定。反向证明了骨髓间充质干细胞的成骨潜能。并观测不同条件对其生长的影响。为更进一步研究骨髓间充质千细胞的生物学特