骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

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1、骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定　　为探索一种简便有效的方法，本研究采用全骨髓贴壁法对骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行分离培养及初步鉴定，以使其更好地服务于临床应用。本研究通过全骨髓分离法获得大鼠BMSCs,化学药物（β-ME）诱导BMSCs分化为神经元样细胞，从细胞的强增殖能力、细胞的表面标记物及分化潜能3方面对分离培养的细胞进行了鉴定，在长时间的未进行换液的体外细胞培养过程中发现BMSCs可能存在自分化现象，笔者认为，自分化对于BMSCs的临床治疗机制的研究极为重要。目前，国内学者对BMSCs的研究涉及较少。　　1材料与方法　　1.1实验动物清洁

2、级2周龄雄性大鼠一只（体质量75g,由桂林医学院实验动物中心提供）.　　1.2试剂DMEM/F12和胎牛血清；胰蛋白酶；兔抗大鼠FITC-CD29、PE-CD90单克隆抗体；兔抗大鼠Nse单克隆抗体，SABC免疫组化试剂盒（北京欣博盛生物科技有限公司）.　　1.3BMSCs的分离、培养及传代大鼠断颈处死，无菌分离四肢长骨，暴露骨髓腔，用注射器吸取无血清培养液反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液，离心（800r/min6min）,弃上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，计数后以109/ml密度接种于25cm2的培养瓶，记P0,37℃培养箱中培养。48h后

3、半量换液，以后每3天换液一次。至10~13d左右，贴壁细胞80%~90%汇合时，0.125%胰酶消化，约1~2min,1传2,记P1,以此类推，利用BMSCs易消化的特点达到纯化目的，须严格控制酶的量和消化时间。每次传代用新培养瓶，以弃去贴壁非常牢固的细胞，通过多次传代对细胞进行纯化。　　1.4形态学观察用倒置显微镜观察并拍照　　1.5BMSCs细胞表型鉴定取生长良好的P3代细胞，制成细胞爬片，用4%多聚甲醛固定30min,10%BSA封闭30min,将适度稀释的荧光标记的单克隆抗体FITC-CD29、PE-CD90分别加入不同的切片上4℃过夜，荧光显微镜下观察

4、荧光分布，拍照。　　1.6BMSCs定向诱导分化取同一批P3代细胞，制成细胞爬片，适当培养待贴壁后分为对照组和诱导剂组。诱导剂组采用1mmol/Lβ-ME的10%FBS低糖DMEM预诱导，24h后用含2mmol/Lβ-ME无血清低糖DMEM诱导6h,对照组中不加诱导剂，一直培养。　　1.7神经元样细胞的免疫组化鉴定采用SABC免疫组化法，用4%多聚甲醛固定30min,0.1%TritonX-100透膜30min,3%H2O2/甲醇消除内源性过氧化物酶，封闭血清孵育20min,将一抗（兔抗大鼠Nse）按适当比例加于玻片上，4℃湿盒内过夜，次日加

5、生物素化二抗后37℃下孵育30min,加SABC,DAB显色，苏木素复染，观察，拍照，以PBS代替一抗作阴性对照。　　2结果　　2.1倒置显微镜观察原代分离的细胞大小均一、圆形、折光性强，悬浮，红细胞居多；48h后可见部分细胞贴壁，成短梭形；4~5d开始快速增殖；培养8~10d后细胞渐铺满培养瓶，成长梭形，漩涡状生长（图A）,此时结束原代培养，进行传代扩增，以去除结节状分布的小圆形细胞（图B）和长梭形的贴壁性强的成纤维样细胞（图C）.传代培养的细胞3~4h即贴壁，细胞增殖后以梭形为主，排列有明显方向性（图D-F）.不添加任何生长因子，细胞传5~6代左右，老化现象

6、严重。　　2.2BMSCs表型鉴定P3代细胞免疫荧光显示BMSC的表面标记物CD29、CD90阳性（图G-H）.　　2.3BMSCs的神经元诱导结果倒置显微镜观察，BMSCs在1h左右开始，即发生形态变化，扁平、梭形的细胞胞浆回缩，向核集中，1~3d后出现多个延长的胞体突起，类似于神经元样细胞的假足（图I）;而空白组始终未变化（图J）.免疫细胞化学染色显示，实验组神经元样细胞的胞体及部分突起成棕黄色，Nse阳性表达（图K-M）;与诱导组同时间点的空白组几乎全为阴性（图N）.　　2.4未加任何诱导剂组空白组培养30d左右时BMSCs的自分化观察，可见神经样细胞和圆

7、形透亮的凋亡细胞。（图O-Q）。　　3讨论　　BMSCs是骨髓中除造血干细胞以外的非造血性干细胞，正常时只有极少数在增殖期，在骨髓中的丰度很低，约占骨髓有核细胞的0.001%~0.01%,但取材方便，易于体外分离和扩增，具有多向分化的潜能.目前获取BMSCs的方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞分选法、免疫磁珠法4种.本实验通过全骨髓贴壁法，利用细胞不同的贴壁特性，随传代完成对BMSCs的纯化，并通过诱导证实了其分化能力，为今后进一步的研究和应用奠定了基础。　　干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的尚未分化的原始细胞，具有经培养不定期的分化并产生

8、特化细胞的能力，根据不同