小鼠cxcr4基因的克隆和慢病毒介导的表达

《小鼠cxcr4基因的克隆和慢病毒介导的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、小鼠CXCR4基因的克隆和慢病毒介导的表达作者：王莉,胡轶阳,王耀春,韩骅【摘要】目的:克隆小鼠CXCR4基因并建立其慢病毒表达系统。方法:设计合成PCR引物,从小鼠骨髓有核细胞来源的cDNA中扩增并克隆小鼠CXCR4基因的编码区。构建CXCR4IRESGFP表达单元后通过转染细胞,观察GFP的表达证实其表达效能。然后建立慢病毒表达载体,包装慢病毒后感染培养的细胞,用流式细胞术分析其在被感染的细胞中的表达。结果:成功扩增了小鼠CXCR4基因的编码区。克隆入质粒载体后经DNA序列测定证实了其序列。通过转染细胞和流式细胞术以及荧光显微镜观察证实了CXCR4IRE

2、SGFP的表达效能。成功构建了CXCR4慢病毒表达载体,感染细胞后经流式细胞术分析,证实被感染的细胞可以表达小鼠CXCR4。结论:成功扩增、克隆了小鼠CXCR4基因,并成功建立起其慢病毒表达系统,为后续的基础和应用研究奠定了基础。【关键词】CXCR4;基因;表达;慢病毒CXCR4是趋化因子SDF1a的受体,广泛表达于机体的多种组织细胞。CXCR4广泛参与胚胎发育、神经发生、造血和创伤修复和肿瘤侵袭转移等生理和病理过程。CXCR4基因剔除小鼠在胚胎发育早期死亡,伴随有多种组织器官的发育障碍,9说明了CXCR4具有广泛而重要的生物学功能［1］。在细胞水平,CXCR4

3、不仅介导细胞针对其配体SDF1a的趋化性迁移,而且调控细胞的增殖、分化和凋亡等细胞生物学行为［2,3］。例如,树突状细胞（dendriticcells,DC）是体内功能最为强大的专职抗原提呈细胞。2007年,Kabashima等［4］报道了SDF1aCXCR4信号途径不仅对DC的迁移十分重要,而且发现这一信号通路还在DC的生存和成熟中发挥重要作用［5］。Kohara等进而证明,当浆样DC（plasmacytoidDC,pDC）在骨髓基质细胞龛中发育时,也需要CXCR4信号。此外,大量的其他研究还证明CXCR4也在其他类型的细胞中发挥类似作用。最近,我们在研究中发

4、现CXCR4可能是骨髓单核细胞来源的DC成熟的重要调控分子,这一结果提示干预CXCR4有可能应用于DC相关的细胞治疗［6］。为了探索这一可能性,本研究克隆了小鼠的CXCR4基因,并利用慢病毒表达系统进行了表达。1材料和方法1.1材料质粒、细菌品系和细胞系:逆转录病毒载体pMxIRESGFP由本室保存。慢病毒表达载体pLentiEGFP和包装细胞293FT由预防医学科学院北京病毒研究所吴小兵教授提供。HeLa细胞系由本室保存。大肠杆菌DH5a由本室保存。抗小鼠CXCR4Biotin抗体和AvidinFITC购自BDPharmingen公司。91.2方法1.

5、2.1细胞培养和转染细胞用DMEM培养基（含100mL/L胎牛血清和2mmol/L的L谷氨酰胺）在50mL/LCO2、37℃、饱和湿度条件下进行培养。细胞转染用脂质体（Lipofectamine2000,购自Invitrogen公司）介导进行。细胞培养于6孔板中。当细胞生长至85%接触时,更换培养液,然后缓慢滴加脂质体DNA混合液。培养6h后再次更换培养液,并继续培养至下一步试验。1.2.2RNA提取和RTPCR采集正常小鼠骨髓,用0.14mol/LNH4Cl裂解红细胞后得到骨髓有核细胞。向细胞沉淀中直接加入TRIzol提取液（Invitrogen）裂解细胞

6、,经过酚氯仿抽提后得到总RNA。以随机引物为引物、利用反转录试剂盒（TaKaRa公司）将总RNA反转录成cDNA,再利用以下引物扩增小鼠CXCR4的编码区基因:CXCR4F:5′GCCATGGAACCGATCAGTGTGAG3′;CXCR4R:5′TGCATAAGTGTTAGCTGGAGTG3′。1.2.3分子克隆DNA酶切、连接、大肠杆菌转化等分子克隆操作完全按照已有进行。DNA序列分析委托TaKaRa公司进行。1.2.4慢病毒包装和感染CXCR4的cDNA与IRESEGFP融合后,9共同插入pLentiEGFP载体中并替换掉其中EGFP片段

7、,得到慢病毒表达载体pLentiCXCR4GFP。病毒包装过程如下:接种2×106293FT细胞于90mm大皿,次日细胞基本覆盖皿底的95%以上;于5mL的离心管中加入1.5mL无血清1640培养液,在其中加入18μg包装复合物和6μgpLentiCXCR4EGFP质粒,轻柔混合;取另一支5mL离心管,加入1.5mL无血清1640培养液,在其中加入60μL脂质体2000,室温静置5min;将二者轻柔混合,室温静置20min。吸弃293FT细胞培养液,3mLPBS洗1遍,将质粒脂质体混合物滴加到培养皿中,轻柔摇匀,37℃培养过夜。第2天更换无抗生素的全培养

8、液,第4天