突变型人app基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建

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1、突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建作者：张丽娟王凤斌成敏刘蓉【摘要】目的构建携带突变型人淀粉样前体蛋白基因(APP695)与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合载体。方法在NCBI上查找APP695的序列，设计引物。以pCB6质粒携带的野生型APP695序列为模板，以突变体引物扩增突变型APP695。将突变型APP695与pIRES2EGFP连接并测序证实。结果经过酶切鉴定、PCR和DNA测序等方法，证实构建的pIRES2EGFP/APP695突变型质粒载体序列正确。结论成功构建APP695EGFP融合基因载体，为研究AD发病的分子机制和治疗时的药物

2、筛选奠定基础。【关键词】瑞典突变APP695；增强型绿色荧光蛋白；APP695EGFP融合基因；载体【Abstract】ObjectiveToconstructandexpressarebinantvectorbearingfusiongeneofhumanamyloidprecursorprotEin(APP)695mutantgeneandenhancedfluorescenceprotEIn(EGFP)fusiongene.MethodsTheprimersNCBI.ThenthemutantAPP695plifedbyPCRanAPP695andactingasatem

3、plate,thegeneofmutantAPP695idofpIRES2EGFP/APP695mutantutantvectoredbydigestionofrestrictionendonucleases,PCRandsequencing.ConclusionsThepIRES2EGFPAPP695mutantfusiongenerebinationhasbeenconstructedsuccessfully,utantAPP695；EGFP；FusiongeneofhumanAPP695/EGFP;Vector　　淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprot

4、ein，APP)基因是Alzheimer病(AD)已发现的诸多相关基因之一。APP基因某些位点的突变可以引发某些家族的早发性AD，故APP的突变在AD发病中的作用引起了广泛关注。本研究应用增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein，EGFP)作为报告基因，将APP695突变基因与其融合，构建突变型APP695EGFP融合基因载体，为进一步研究APP695突变在AD发病中的作用，以及筛选对AD有治疗作用的药物奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　携带野生型人类APP695的pCB6质粒，由美国加利福尼亚大学细胞分子医学院许华熙博士惠

5、赠。携带EGFP的pIRES2质粒载体，由潍坊医学院免疫学教研室保存，DH5α感受态细胞为潍坊医学院免疫学实验室冻存。NheⅠ、HindⅢ、SmaⅠ、XbaⅠ等限制性内切酶，T4DNA连接酶与TaqDNA聚合酶，引物等均购自上海生工生物工程技术服务公司。　　1.2方法　　1.2.1pIRES2EGFPAPP695融合基因重组质粒的构建　　将携带EGFP的pIRES2质粒载体用NheⅠ、HindⅢ酶切后，采用PCR扩增突变型APP基因，用Premier5软件设计PCR引物，以pCB6APP695野生型质粒载体DNA作为模板，PCR扩增突变APP基因。引物序列为：TA1APP

6、U：5′attgctagcatgctgcccggtttggcactg3′，TA2APPMU:5′tctgaagtgaatctggatgcagaat3′，TA3APPMD：5′attctgcatccagattcacttcaga3′，TA4APPD:5′gttaagcttctagttctgcatctgctcaaag3′。模式：引物TA2、3为一对反向互补的cDNA序列，但在其中引入两个LN,ML的突变，TA1、4包括了整个APP序列，并且含有NheⅠ、HindⅢ酶切位点(图1)。　　先将两个小片段进行PCR扩增得到回收片段，片段大小分别为1785bp、303

7、bp，将获得的两个小片段做PCR连接得到APP695突变全片段，进行PCR条件：94℃3min，循环程序：94℃变性45s，52℃复性45s，72℃延伸2min30s。PCR结束后，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外光下观察结果并照相。　　1.2.2PCR产物APP695突变基因全长连至pIRES2EGFP载体　　流程图见图2。经检测胶证实2088bp的PCR目的基因产物APP695，用低熔点琼脂糖电泳回收纯化后连接到pIRES2EGFP载体，进行质粒转化。　　1.2.3质粒D