人线粒体融合蛋白―2基因真核表达载体的构建与鉴定.doc

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1、人线粒体融合蛋白一2基因真核表达载体的构建与鉴定摘要：目的构建人线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2,MFN2)基因真核表达载体并对其进行鉴定。方法在pEGFP-Nl载体多克隆位点插入人MFN2基因编码区序列，酶切、测序验证是否插入及正确性。将所构建载体转染原代培养的人血管平滑肌细胞(Vascularsmoothmusclecells,VSMCs),荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达;荧光定量PCR和Westernblot分别检测MFN2的mRNA及蛋白表达。结果成功构建了人MFN2基因真核表达载体，其转染VSMCs后，可以检测到MFN2mRNA及蛋白水平高表达(P〈0.01)。结

2、论成功构建了人MFN2基因真核表达载体，且能够在原代VSMC中过表达。关键词：线粒体融合蛋白-2；载体构建；鉴定血管平滑肌细胞(Vascularsmoothmusclecells,VSMCs)的增殖是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)形成的中心环节。线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2,MFN2)是一种细胞增殖抑制因子，能抑制VSMCs增殖［1,2］。本研究拟通过构建人MFN2基因真核表达载体，并将其转染原代人脐静脉平滑肌细胞，荧光定量PCR法及Westernblot检测MFN2mRNA及蛋白表达，为今后研究MFN2在AS中的作用打下良好基础。1资料与方法1.

3、1一般资料原代人脐静脉平滑肌细胞由本实验室培养；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶购自Hyclone公司；大肠杆菌感受态DH5a购自北京博迈德生物科技公司；真核基因表达载体pEGFP-Nl购自Clontech公司；TaqDNA聚合酶购自宝生物公司；限制性内切酶BglII及EcoRI、T4DNA连接酶均购自Fermentas公司；逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自Fennentas公司；TRIzol试剂、转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；兔抗人MFN2抗体购自北京博奥森生物科技有限公司。1.2方法1.2.1原代细胞人脐静脉平滑肌细胞培养与鉴定采用于

4、海娇［3］等方法培养及鉴定原代培养的人脐静脉平滑肌细胞。1.2.2人MFN2基因真核表达载体的构建在NCBI网站查找人MFN2mRNA编码区序列，并设计引物。上游引物：5’-GAAGATCTATGTCCCTGCTCTTCTCTCGAT-3’；下游引物：5，-GGAATTCTCTGCTGGGCTGCAGGTACT-3，，上下游引物分别引入Bglll及EcoRI酶切位点（以下划线标出）。TRIzol法提取人脐静脉平滑肌细胞总RNA并反转录为cDNA,进行PCR扩增；胶回收进行酶切-连接后转化DH5a大肠杆菌，提取质粒经Bglll及EcoRI双酶切及测序鉴定。测序正确者命名为pEGFP-M

5、FN2。1.2.3细胞转染将细胞接种于24孔细胞培养板中，待细胞融合60%〜80%时，设置pEGFP-Nl空质粒对照组及PEGFP-MFN2转染组，每组设三个复孔。按照Lipofectamine2000说明书步骤进行，转染各组后371细胞培养箱中继续培养，6h后更换完全培养液。48h后用荧光显微镜观测各组细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。1.2.4荧光定量PCR检测MFN2mRNA的表达提取转染PEGFP-MFN2细胞的总RNA并反转录为cDNA进行荧光定量PCRo以GAPDH为内参照，根据PCR仪自动生成的Ct值，根据公式：目的基因的相对量=2-AACt计算目的基因的相对表达量。

6、1.2.5westernblot检测MFN2蛋白的表达按照全蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜,5%脱脂奶粉室温封闭2h,分别用抗MFN2和抗3-actin抗体孵育过夜，TBST洗膜；辣根过氧化物酶(1：3000)室温标记1h,TBST洗膜；X光胶片曝光、显影、定影。照像并分析，以3-actin蛋白为内参，用MFN2与0-actin条带像素灰度的比值表示MFN2蛋白的相对表达量。1.3统计学分析结果以表示，应用SPSS11.0统计学软件进行统计学分析，采用t检验进行两样本间比较，以P<0.05为差异有统计学意义。3讨论MFN2是近年发现的具有许多生物学功能的

7、蛋白，在VSMCs以及心、肾等组织中广泛分布［4］。研究发现，高血压大鼠、球囊损伤大鼠和ApoE基因敲除小鼠的VSMCs中Mfn2表达均明显下调。我国学者陈光慧等［1］首次发现MFN2基因控制VSMCs增殖，其机制主要在于MFN2是原癌基因Ras的直接负调控因子，能够与其相互作用，阻滞Ras-Raf-MAPK信号转导通路而将细胞周期阻断在G0/G1期。研究还发现，血管紧张素II、内皮素-1及IL-1等可以通过下调MFN2表达，促进VSMCs的增殖，而相应的