人朊蛋白基因真核表达载体的构建及鉴定-论文.pdf

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1、2434重庆医学2o14年7月第43卷第19期论著·基础研究doi：10．3969／i．issn．1671—8348．2014．19．013人朊蛋白基因真核表达载体的构建及鉴定张海英，刘亦恒。，费小雯，易西南，吴多庆。(1．海南医学院人体解剖学教研室，海口57l101；2．海南省海口市人民医院骨科中心570208)摘要：目的构建人朊蛋白基因(PRNP)真核表达重组质粒。方法从阿尔茨海默病(AD)患者外周血白细胞中提取总RNA，利用RT—PCR的方法扩增编码人PRNP的基因片段，应用基因重组技术将

2、人PRNP基因片段克隆到真核表达载体pEG—FP—N2中，经XhoI及EcoRI双酶切、单酶切及基因序列测定证实所构建的载体。结果RTPCR方法获得人PRNP的基因片段，限制性内切酶酶切分析、PCR法及序列测定证实为正确重组质粒，并且该重组载体能够在sHsY5Y细胞中表达。结论构建的真核表达重组质粒pEGFP—N2一PRNP通过鉴定，结构正确，为后续研究PRNP的生物学功能奠定了基础。关键词：阿尔茨海默病；朊蛋白基因；pEGFP—N2真核表达载体中图分类号：R592文献标识码：A文章编号：167

3、18348(2O14)l9-243403BuildingandidentificationofpriongeneeukaryoticexpressionvectorofhumanZhangHaiying，LiuYiheng，FeiXiaowen，YiXinan，WuDuoqing(1．DepartmentofAnatomy，HainanMedicalUniversty，Haikou，Hainan57110l，China；2．DepantmentofOrthopaedic"，HaikouMunic

4、ipalPeoplesHospital，Haikou，Hainan570208，China)Abstract：ObjectiveToconstructaneukaryoticexpressionrecombinantplasmidnamedpEGFP—N2一PRNP．MethodsTotalRNAwasextractedfromalzheimer(AD)diseaseperipheralblood．andthePRNPgenewasamplifiedbyreversetranscription—

5、poly—merasechainreaction(RT—PCR)．Byusinggenerecombinationtechnique，humanPRNPcDNAwasinsertedintoretroviralvectorpEGFP-N2．TherecombinantplasmidwasidentifiedbyapairofspecifiedprimerscontainingtherestrictionsitesofXhoIandEcoRI．ResultsThePRNPgenecouldbeob

6、tainedbyRT—PCR，therecombinantplasmidwasidentifiedbyrestrictionendonucle—aseanalysis，PCRandsequenceanalysis，andtheexpressionvectorpEGFPN2一PRNP，whichcouldbestablyexpressedinSH—SY5Ycells．ConclusionTherecombinantplasmidpEGFP—N2一PRNPisconstructedsuccessfu

7、lly，WhichoffersabasicforthefurtherresearchonPRNPbiologicalfuction．Keywords：alzheimersdisease；PRNPgene；pEGFP—N2eukaryoticexpressionvector阿尔茨海默病(alzheimersdisease，AD)是一种以记忆和取试剂盒(QIAGEN公司)。认知损害为主要特征的慢性进行性神经系统退行性疾病。主1．2方法要的病理改变为在大脑皮层和海马，出现大量老年斑和神经纤1．2．1总

8、RNA的提取取AD患者静脉血，提取细胞，川维缠结。因它的发病机制并清楚，从而无有效的治疗手段。TRlzol试剂提取总RNA，测定其A260／A280吸光比值，计算有研究发现，A8寡聚体与神经细胞膜上的细胞型的朊蛋白总RN人水平。(celllarprionprotein，PrP‘’)结合，增强了AB寡聚体的神经1．2．2PRNP基[大1的获得根据GenBankI=二人的PRNPcI)毒性。PrP是由染色体基组朊蛋白基因(prionproteinNA功能全长序列，设计一埘引物并导入XhoI和EcoR