人hgfk1真核表达载体的构建及鉴定

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1、温州医学院硕士学位论文人HGFKI真核表达载体的构建及鉴定中文摘要目的克隆入HGFKI基因，构建其重组真核表达载体，转染HepG2细胞，观察HGFKI基因在HepG2细胞的表达，为研究HGFKI的生物学效应和肝癌的基因治疗作相关基础工作。方法1．HGFKI基因的克隆与重组克隆载体的构建及鉴定j‘由冰冻人胎盘组织提取总RNA，行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获HGFKI基因cDNA，与pGEM—TEasyVector连接，构建重组克隆载体pGEM-TEasy—HGFKI。重组克隆载体以CaCI：法转化E．ColiDH

2、5a并行氨苄青霉素(200pg／m1)筛选，采用菌落直接PCR、XbaI和HindIll双酶切及序列分析等方法，证实目的片段的存在和序列正确。2．重组真核表达载体pcDNh3．1(0-HGFKI的构建与鉴定将转化重组克隆载体pGEM-TEasy—HGFKI的E．ColiDH5cc增菌后，提取重组载体行XbaI和HindIII双酶切，电泳胶回收目的片段并测定浓度，与经相同双酶切的载体pcDNA3．1(一)提取物连接成重组表达载体pcDNA3．1(一)-HGFKI。将重组表达载体转化到E．ColiDH5a并行氨苄青霉素(2

3、00gg／m1)筛选，经菌落PCR、XbaI和HindIII双酶切等方法确定目标片段的存在和序列正确。3．细胞转染与阳性克隆的鉴定采用脂质体转染法行重组表达载体的转染。以仅加脂质体HepG2细胞为空白对照，空载体pcDNA3．1(一)转染后HepG2细胞为阴性对照。37℃、5％CO。静置培养48h后，消化细胞提取总RNA，RT—PCR，电泳，检NH6FKl基因的存在以确定成功转染。4．HGFKl基因转染后蛋白表达的检测取对数生长期的HGFKI基因转染后HepG2细胞，采用Westernblot检测HGFKI蛋白的表达。

4、以空载体pcDNA3．1(一)转染组作为对照。结果1．HGFKl基因的克隆、重组克隆载体pGEM-Teasy-HGFKl的构建与鉴定冰冻人胎盘组织提取总RNA后行RT-PCR，可见一约827bp的特异性条带，与目的片段大小一致(827bp)，提示HGFKIcDNA片段成功扩增。将pGEM-TEasy—HGFKI转染E．ColiDH5ct，筛选出阳性菌落。将阳性菌落PCR产物、重组克隆载体XbaI和HindIII双酶切产物行电泳检测，可见与目的片段大温州医学院硕士学位论文小一致的特异性条带(827bp)，测序结果与Gen

5、ebank报道的序列相同，提示pGEM-TEasy—HGFKI成功构建。2．重组真核表达载体pcDNA3．1(一)-HGFKI的构建与鉴定将重组表达载体pcDNA3．1(一)-HGFKI转染E．ColiDH5a后采用氨苄青霉素筛选出阳性菌落。将阳性菌落PCR产物行电泳检测以及重组表达载体XbaI和HindII双酶切产物电泳检测，均发现与目的片段大小一致的特异性条带(827bp)，提示pcDNA3．1(一)一HGFKI获成功构建。3．转染后阳性细胞的筛选与鉴定取常规培养HepG2细胞、阴性对照和实验组的细胞提取总RNA，

6、行RT-PCR。扩增产物经电泳发现实验组存在特异性条带(827bp)，而常规培养HepG2细胞、阴性对照均无，提示重组表达载体pcDNA3．1(一)-HGFKI已成功转染，且对照组及阴性组均无HGFKImRNA表达。4．转染后HGFKI蛋白表达的检测Westernblot结果表明，HGFKI基因转染后HepG2细胞的培养液存在大小约28kDa的蛋白条带，而对照组无蛋白条带。结论HGFKI基因获成功克隆并构建了重组真核表达载体pcDNA3．1(一)-HGFKI。转染HGFKI基因后的HepG2细胞经RT-PCR发现存在特

7、异性DNA片段。HGFKI基因在HepG2细胞中可表达HGFKImRNA和蛋白。上述结果将有助于深入研究HGFKI的生物学效应及对肝癌进行基因治疗的探索。关键词HGFKI；HepG2细胞；转染；表达2温州医学院硕士学位论文CloningandIdentificationofthehumanHGFKlGeneRecombinantEukaryoticExpressionPlasmid．AbstractObjectiveToClonethehumanHGFKlgenerecombinantinaeukaryoticexpr

8、essionvector，andtransfecttherecombinanttothehapmomacelllineHepG2．TlleproteinexpressionoftheHGFK1inthetransectedcellswasinvestigated．Methods1．Cloningandidentificationo