hbmp2和hfgf2双基因共表达重组腺病毒载体的构建与鉴定

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1、hBMP-2和hFGF-2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定中文摘要【目的】构建人骨形态发生蛋白2m瞰啪bone删哪)hog髓而cpm钯酢2，hB砌-2)和人成纤维细胞生长因子2彻珊觚fib袖last朗)、砒自咖r．2，hFGF-2)双基因共表达重组腺病毒载体，并对其鉴定，为后续基因治疗和细胞移植实验提供实验基础。【方法】通过引入内部核糖体进入位点序列(砷舶讨幽鲫鹏咖s娩，眦S)，采用基于九噬菌体位点特异性重组系统的Q眙wa∥伽技术构建带有hB御．2和hFGF·2双基因共表达重组腺病毒载体。用聚合酶链式反应(po

2、lyl蝴chain豫厕册，PCR)方法扩增hBMP．2和hFGF．2目的基因，将两个基因亚克隆至p琢匠S2．EGFP中，构建邮MP2-琢正S城7G．F2，菌落PCR、双酶切电泳及测序鉴定。通过BP反应将hBMP2．Ⅱ冱S．hFGF2重组到载体p￡H3Nl也21中，再通过LR反应将其转移到腺病毒载体∥岫／CMVⅣ5．DEST中。测序鉴定重组成功后将其线性化，脂质体转染线性化的重组腺病毒载体于293细胞以包装制备重组腺病毒Ad-hBMP2．Il冱S．hFGF2。重组腺病毒经PCR鉴定之后反复感染293细胞进一步扩增并纯化

3、。通过免疫法测定腺病毒滴度。【结果】成功扩增出hBMP．2和hFGF-2基因片段，phBMP2．琢正S枷PGF2经菌落PCR、双酶切及测序鉴定正确。提取重组腺病毒基因组成功扩增出外源目的基因hBMP-2和hFGF．2片段，重组腺病毒在293细胞中包装成功，获得成熟的病毒颗粒，测得病毒滴度为2．82×101岫。【结论】．．．，成功构建携带hBMP-2和hFGF．2双基因共表达重组腺病毒载体，收获的病毒具有较高滴度，为以后利用腺病毒载体进行hBMP．2及hFGF-2双基因共表达干预骨修复的体外及体内研究提供实验基础。【关

4、键词】人骨形态发生蛋白2；人成纤维细胞生长因子2；腺病毒载体；内部核糖体进入位点序列。2Constructionandidenti矗cationofrecombinantadent丽rusVectorco-expIIessinghBA们睢2andhFGF-2genes【obj佻倚嘴】T0伽ls嘲me舢mbin碰础枷v∞铆渺exp煅s她llB凇andhFGF2g饥esandt0豫诹me鲥矧舢mbin觚鸭∞鹪屯0layaf0嘁蜥∞for恤跚b∞q啪tge鹏t11e婶y锄d∞Il蛔nspl锄蜘0f锄砌懿联痂nents．【M

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