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1、基因克隆,载体构建和转化1.基因克隆2.连接到测序载体3.连接到表达载体4.转化农杆菌5.转化植物6.阳性植株筛选和鉴定1.基因克隆PCR:低温操作模板:cDNA或基因组DNA,可调.注意换枪头,样品间不能污染引物:1ul/12.5ul体系,上下游引物混合,分装PCR预混液:10ulPCR程序:根据要扩增的长度调整:退火温度(52-68度)延伸时间:rTaqase:1kb/分钟其它酶略长PCR仪:要登记,正确操作,用完关掉电源,拔下电源插头或关掉插排电源,盖子半盖,盖上罩子PCR预混液(10ul),分装,-20度保存H2OBuffer：完全化开，分装dNTP:低温化开，分装rTaqase:最
2、后加,低温存放,混匀(用枪头)（因有甘油，酶常存在底部）电泳检测:6－10ul上样即可加Maker（3ul）：分子量是否正确是否有非特异条带(若有,提高退火温度)电泳及凝胶成像系统操作:电泳缓冲液倒入专门的广口瓶内制胶板,梳子要及时清理凝胶成像系统操作区为非污染区,勿污染扫胶后立即关掉紫外灯图片保存后关掉凝胶成像仪开关最后关掉电脑若能扩增出分子量正确的单一条带:1)PCR循环调为26-28个2)模板量增加3)更换保真性高的的Taqase,如:LATaq(扩增长度1kB以上)PfuTaq(保真性最高,但需要加尾)取6ul电泳检测,剩余-20保存,连接用若用Pfu酶,则需要加尾2.连接到测序载体
3、并转化大肠杆菌连接:按照试剂盒说明操作连接buffer要分装连接buffer要完全融化再用可在4度冰箱接着连接1-3天转化大肠杆菌感受态细胞:感受态细胞要在冰上融化,上下颠倒混匀加样在超净台上进行,加样混匀要上下颠倒,不能用枪头混.42度热击温度时间要严格,用温度计标温度.含Amp的LB平板上加X-gal,IPTG时,将IPTG加在X-gal上涂平,放在超净台上最后涂平板时一定要涂匀,并等到表面干燥后再用封口膜封好,倒置培养,37度,12h左右.阳性菌落的鉴定挑选白色菌斑,重新在新的LBA平板上划线培养12h左右.在超净台上用白色枪头挑去微量菌落加入PCR混合物中,进行PCR鉴定程序同上,3
4、0循环,退火温度降低质粒PCR选2-3个菌落PCR鉴定出的菌落5-6mlLB液体培养基(加Amp,1000倍母液)过夜,37度培养.在超净台各取1ml菌于1.5ml无菌离心管内于4度保存同时取0.5ml菌液,加入0.1ml无菌甘油,混匀,-40或－80度保存.剩余菌液用于提质粒,用质粒做模板,进行PCR鉴定注意：菌种的标记（标签纸）测序载体：pMD－at1392pMD－RGT表达载体：pBI121－RGT－E（E.coli）转化农杆菌：pBI121－RGT－A（Agrobacteriumtumefaciems）质粒提取:用前先检查药品和柱子是否够用检查相应试剂状态加Rnase加乙醇澄清离心前
5、平衡**水域锅用完关掉**测序选出能通过质粒PCR扩增出的菌液(4度保存,当天送样测序),用封口膜封好,填好测序单,送样测序,保存好存根.DNA限制性内切酶消化酶切如何做酶切反应？正确使用和保存酶:酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来，取酶时放于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下部含酶的部分，用完后需要及时送回原处。加酶后用枪头充分混匀（内含甘油）注意：酶通常是最后加。模板DNA:纯度:充分去除杂质,用含有去蛋白试剂的试剂盒,DNA样品中不能含有有机溶剂（提取质粒时不能有乙醇残留,washbuffer)浓度：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度
6、过低，酶切产物不够.提取质粒后取5ul电泳,确定浓度反应体积:酶切鉴定20ul,需要回收连接则相应扩大体系最后加酶混匀:（因有甘油，酶常存在底部）需要用枪头小心混匀几次,甩到管底。不能使用振荡器混匀。反应时间:3-4h。双酶切酶切buffer:平衡两种酶酶切温度:酶切时间:酶切效率酶切体系:1ul酶/20ul体系酶切后电泳,回收电泳:更换新的电泳缓冲液胶:浓度低的胶,厚,上样量尽量多切胶:选准片段,快,减少紫外注射的时间切胶:尽量去除多余的无样的胶回收：胶要充分溶解，注意:EB污染手,枪等用20-25ul两次冲洗,共得到20ul左右电泳:3－5ul上样，加相同量的Maker,确定浓度电泳判断
7、大小片段浓度时，应考虑其自身分子量的差异反应必须于16℃进行。当连接反应难以进行时，可以适当延长反应时间。4度延长连接时间。如何提高连接的效率，防止假阳性的产生？连接前使用碱性磷酸酶，去除载体5’端的磷酸抑制质粒的重新环化。调节外源DNA和克隆载体的比例平末端：PEG拟南芥转化，筛选侵染：收种子：2－3次筛选：收完及时筛选
