《基因克隆载体》PPT课件(I)

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1、3基因克隆载体定义通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。也称DNA克隆载体。必备条件1、克隆位点(一个或多个)2、能携带外源DNA片段进入受体细胞:能自我复制，或整入染色体随受体细胞DNA复制而复制。3、有选择克隆子的标记基因4、安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞)意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域。按克隆载体的来源分：质粒～病毒或噬菌体～质粒与病毒或噬菌体DNA组成的～质粒与染色体DNA片段组成的～按应用范围分：表达型～启动子探针型～cD

2、NA～按应用对象分：原核生物～植物～动物～分类３.１质粒克隆载体定义：以质粒DNA为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和cDNA基因文库。一、质粒适于载体构建的性质１、组成与构型是染色体外裸露的双链DNA分子（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）构型：l-DNAoc-DNAccc-DNA２、分子大小：100～102kb３、复制特点：在宿主细胞内；单向；质粒和宿主细胞双重遗传系统控制复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）（１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定严紧控制型：1~数个拷贝；大质粒松驰控制型：10个以上拷贝

3、；小质粒。经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）。（２）质粒复制的控制因素cop基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续复制。rep基因：指令宿主合成一种调节蛋白，促进质粒的复制par序列：附着在细胞膜上，使质粒随细胞分裂而正确地分配到子细胞中，维持相对稳定的拷贝数４、质粒的不亲合性亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒５、质粒迁移（１）

4、接合质粒：含tra基因→合成细胞表面物质（鞭毛）→质粒DNA入受体细胞含tra基因的质粒称为接合质粒。如F、Ti等不含tra基因的质粒称为非接合质粒。如ColE1、pPbS等（２）迁移作用不含tra基因而含bom（oriＴ）位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒mob基因产物时，即可打开oriＴ位点，非结合质粒借助接合质粒tra基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称～质粒的迁移作用６、显性质粒和隐蔽质粒宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质粒。显性质粒Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药

5、物的抗性基因，可作为选择标记。Col质粒Ｆ质粒降解质粒Ｔi质粒隐蔽质粒蓝藻内源质粒二、质粒克隆载体构建的基本策略１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝）２、克隆位点——组装MCS连杆３、选择标记基因——抗性基因，LacZ’基因４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等三、质粒克隆载体构建过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组）构建原则1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子2、正确获得构建质粒克隆载体的元件3、组装合适的选择标记基因

6、4、选用合适的启动子5、构建过程力求简单代表性实例。（一）pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建Ⅰ、pBR322构建质粒载体命名法则“pBR322”p：质粒（plasmid)BR：两位主要构建者322：实验编号pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧型ColE1松驰型，筛选系统复杂构建过程(出发质粒：pMB1)R1（沙门氏菌中分离）变异R1drd19（含易位子Tn3Apr）R1drd19Tn3pSF2124ColE1pBR322的三个亲本：pMB1、pSF2124、pSC101识别位点：Apr基因区（3个）：PstⅠ、ScaⅠ、PvuⅠ

7、Tcr基因区（7个）：BamHⅠ、ScalⅠ、EcoRⅤ、SphⅠ、NheⅠ、NruⅠ、XmaⅢTcr启动子区（2个）：ClaⅠ、HindⅢpBR322分子大小：4363bp3、优点（1）较小的分子量10kb以内DNA分子纯化过程中可避免断裂，pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的外源DNA（2）较高的拷贝数经氯霉素扩培后达1000～3000copys/cell（3）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。插入失活（图解）Ⅱ、pUC18/19质粒载体与pBR322区别：乳糖操纵子的一个DNA片段（lacZ`基因）替换Tcr基因；

8、组装了一个多克隆位点（MCS）连杆命名pUC——UniversityofCalifornia的科学家首先构建。图3-3。pUC包括四个组成部分：（1）pBR322的