《基因克隆载体》ppt课件

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1、基因克隆载体第一节　基因克隆载体的特点与分类1基因克隆载体的含义及特点含义：能够把外源DNA片段带入受体细胞并进行稳定遗传的DNA或RNA分子．MCSMarkerForeigngene基因克隆载体的特点特点:1）具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点．2）进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与染色体整合在一起．3）在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合的受体细胞染色体DNA一起复制．4）外源基因能在受体细胞中表达．5）克隆载体进入细胞后有可供选择标记２克隆载体的分类a)质粒载体：大肠杆菌质粒载体，枯草杆菌质粒载体，酵母质粒载体，农杆菌质粒载体，蓝细菌质粒载体b)噬菌体载

2、体：双链DNA噬菌体载体λ；单链DNA噬菌体载体，M13，T3，T7c)病毒载体：植物病毒载体CaMV（花椰菜花斑病病毒）；动物病毒载体SV40（猿猴空泡病毒）d)质粒和噬菌体DNA兼有的载体：Phasmid载体（含有f1噬菌体的ori）；Cosmid载体（含有λDNA的Cos区）e)染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmidvector）基因整合平台系统；ＹＡＣ克隆载体2.1按构建克隆载体DNA的来源分类2.2按克隆载体的用途分类a)cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3，b)原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3c)原核基因融合（Prokary

3、oticgenefusion）载体：pGEX-2T，pGEX-3Xd)真核（Eukaryotic）表达载体：pSVK3，pBPVe)转录（Transcription）载体：pSL1190f)普通载体（Generalvector）：pBR322，pUC18第二节质粒克隆载体质粒(plasmid)是一种存在于宿主细胞中染色体外裸露的双链DNA分子．１质粒载体的一般特性1）质粒的组成与构型细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子细胞外：超螺旋、开环，线形双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）质粒DNA分子的大小:细菌质粒的大小相差较大，小的仅不足1k

4、b，大的可达数百kb.不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不同的质粒不能存在于同一细胞中．可转移性：质粒可通过接合作用等方式转移到新的宿主细胞中．复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向复制，其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双重控制，质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序列．质粒载体的特性质粒上的相关基因A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积累到足以阻止质粒的复制．B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制．C）Inc

5、基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同一宿主细胞中．D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物，促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移．E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr．F）产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）．G）降解基因：降解重金属、有机物和农药等．H)致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒．２几种常见的质粒载体１）pBR322：pBR3224363优点：1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。2、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。3、具有较高的

6、拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始点，部分缺失的Lac操纵子片段，并在LacZ’区组装了MCS．pUC18-19多克隆位点3）pBluescriptM13：含有M13噬菌体DNA复制起点的载　体，该起点以互为相反方向插入到含有T3和T7噬菌体启动　子的一个来自pUC质粒的载体当中．4）Ti质粒载体人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。1907年Smith和Townsent等首先发现这

7、种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化1、T-DNA区：转移DNA，农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞上的一段DNA2、Vir区：毒区，激活T-DNA转移。与T-DNA区相邻，二者共占Ti质粒DNA的1/3。3、Con区：接合转移编码区，该区存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。4、Ori区：复制起始区病毒区基因及功能Ti质粒T-DNA的边界序列３质粒载体的构建1）构建的质粒载体能转化受体细胞,并在其中进行松弛型复制.*选择松弛型质粒复制起始子(O