rmlc反义rna载体的构建及表达

《rmlc反义rna载体的构建及表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：圣盎签字日期：旌丑年—垒月丘日学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大

2、学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。论文作者签名：至叠指导教师签名：墨亟蔓签字目期：私垒2_年尘月监目rmlC反义RNA载体的构建及表达硕士研究生：指导教师：指导小组：专业名称：王奇马郁芳教授辛毅教授生物化学与分子生物学摘要目的：结核病是危害人类健康的最严重的传染病之一，自20世纪80年代起，已经受到控制的结核病疫情再次抬头。主要原因之一是耐多药的结核分枝杆菌菌株的同益增加，而现有的抗结核药物不能有效地治愈结核病，导致结核病患者的死亡率显著增加。因此，迫切需要研发有效的抗结核新药。结核分枝杆菌(M

3、ycobacteriumtuberculosis)是引起结核病的病原体。随着研究的深入发现结核分枝杆菌的细胞壁在其生存和增殖过程中起着重要的作用，并且细胞壁的组成成分和结构比较独特，是理想的药物作用的靶标。被分枝菌酸酯化的聚阿拉伯糖与聚半乳糖通过衔接双糖(L．鼠李糖一D．N．乙酰葡糖胺)共价连接到肽聚糖分子上，以形成分枝杆菌细胞壁的核心结构。衔接双糖是一重要的连接结构，破坏这一结构，细胞壁的完整性将遭到破坏从而结核分枝杆菌不能生存。衔接双糖中鼠李糖的糖基供体是dNTP．鼠李糖，四种酶(rmlB，rmlD，rmlA，rmlC)参与了由底物葡萄糖．1．磷酸合成dTDP．鼠李糖

4、的过程，编码这四种酶的基因存在于结核分枝杆菌基因组中的不同位置。前期工作中，用基因敲除技术证明了rmlC是分枝杆菌必需生长基因。但是，当rmlC低表达时对结核分枝杆菌细胞壁的合成和细胞形态变化的影响还不清楚，需要进一步研究。本论文的目的是构建rmlC反义表达重组质粒pMind．rmlC．AS。构建pET29b—rmlC表达重组质粒，表达并纯化RmlC蛋白免疫小鼠，制备小鼠抗RmlC蛋白多克隆抗体。电转化反义表达重组质粒pMind—rmlC—AS到Mycobacteriumsmegmatisme2l55(以下简称me2155)中，用不同浓度的四环素(Tetracycline

5、，Tc)诱导其表达。对Tc诱导后RmlC蛋白的表达量进行检测，迸一步研究rmlC基因对耻垢分枝杆菌me2l55细胞壁生长情况的影响，为抗结核药靶标选择提供理论支持。本论文所获得的结果：1．rmlC反义RNA表达载体pMind—rmlC．AS的构建从TIGR(http：／／www．tigr．org／tdb／)的耻垢分枝杆菌mc2l55基因组数据库获得SmrmtC基因的核苷酸序列(606bp)。根据其核营酸序列设计～对PCR引物，并在上游引物和下游引物的5’端分别引入了BamHl和Ndel限制性内切酶位点。以mc2155基因组DNA为模板，利用PCR技术，扩增rmlC基因。将

6、纯化的PCR产物与pSTBluel连接，连接产物转化到NovaBlue感受态细胞中，用限制性内切酶BamHI和Ndel，XbaI鉴定出阳性重组质粒，用测序引物T7primer对PSYBlue1一rmlC中的rmlC片段进行DNA亭列测定，将DNA测序结果与已知的rmlC基因进行比对分析，结果表明所克隆的rmlCDNA片段没有碱基突变。用限制性内切酶BamHI和NdeI酶切pSTBIueI-rmlC，回收与纯化rmICDNA片段后与pMind连接，连接产物转化到DH5cc感受态细胞中，用限制性内切酶BamHI和NdeI鉴定出阳性重组质粒。2．表达载体pET29b—rmlC的

7、构建从http：／／www．tigr．org／tdb／的数据库中获得rmlC基因的核苷酸序(606bp)。根据其核苷酸序列设计一对PCR引物，并在上游引物和下游引物的5’端分别引入了NdeI和XhoI限制性内切酶位点，以便将rmlC基因克隆到pET29b表达载体的NdeI和XhoI位点。以illC2155基因组DNA为模板，利用PCR技术，扩增rmlC基因。将纯化的rmlC基因与DMDl8．T载体进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌NovaBlue菌株的感受态细胞中。用蓝白斑筛选法选出阳性菌落，用限制性内切酶XhoI、SacI和