甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

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1、第30卷第9期热带作物学报Vol-30No．92009年9月CHINESEJOURNALOFTROPICALCROPSSep．2009甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草喻时周，。，张树珍，杨本鹏p，蔡文伟，罗遵喜，顾丽红裹农显业部曩热謇带作翥物差生物蓥技秉术圭重点葬开放篓实蠢验霎室海碍口5711012海南大学农学院．海口570228摘要根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列．在开放阅读框两侧设计特异引物．通过PCR扩增引入相应的酶切位点，把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段。分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29

2、A启动子和NOS终止子之间，构建了其正义植物表达载体DCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP。采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导人根瘤农杆菌菌株EHA105中．通过农杆菌介导法对烟草进行转化，经过12mg／L的PPrr连续抗性筛选．共获得23株抗性植株．对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测．分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株。PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中．这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础关键词甘蔗；锌指蛋白；植物表达载体：遗传转

3、化中图分类号$566．1：Q943．2锌指蛋白znicfingerprotein)是一类具有“手指状”结构特征．通过结合Zn2+来稳定一种很短的可自我折叠成“手指”的结构蛋白【lJ。高盐、干旱和低温等非生物胁迫是影响植物生长发育和作物高产的重要限制因子，植物对逆境的应答主要通过效应基因和调节基因调控，而锌指蛋白是一个庞大的转录因子家族。它在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育、增强植物对盐渍逆境的抵御能力方面具有重要作用嘲目前，在拟南芥[31、棉花[4]、矮牵牛【5】、水稻、小麦【3删、白菜【圳、马铃薯[-”、苹果【、胡杨【、橡胶【、陆地棉旧、油菜㈣等植物中已有锌指蛋白基因的报道本研究将克隆

4、得到的甘蔗ShZP基因分别构建了其正义植物表达载体和反义植物表达载体．通过叶盘法对烟草进行转化．以期为甘蔗5基因的抗逆性分子研究奠定基础1材料与方法1．1材料烟草种子(NicotianatabacumL)红花大茎子叶、大肠杆菌(DH5ot)、根瘤农杆菌菌株(EHA105)和中间载体pCRBI由本实验室保存；各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR试剂、AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒、AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒、高保真TaqDNA聚合酶、pMD18一TVector、DL，2000DNAMarker等均购自TaKaRa公司；1KbLadderDNAmarker(300bp一1

5、0000bp)购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；PCR引物由上海生物工程公司合成；卡那霉素(Kan)、链霉素(Str)、羧苄青霉素(Car)、利福平(Rif)、氨苄青霉素(Amp)、琼脂糖购自Sigma公司。基金项目：国家863重点项目(NO．2008AA10Z114)和中央级公益性科研院所基本科研业务费资助：现代农业产业技术体系建设专项甘蔗综合试验站站长经费资助。作者简介：喻时周，硕士。研究方向：植物基因工程应用。E-mail：yushizh0u2008@I63-c0m。}通讯作者，杨本鹏。E—mail：y-bp@163．com；Tel：0898—66986392。收稿日期：2009—

6、03—12修回日期：2009—04—299期喻时周等：甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草13311．2方法1-2_1甘蔗ShZP基因正义反义目的片段的扩增根据本实验室已克隆得到的甘蔗锌指蛋白cDNA序列设计并合成特异引物．引物5端带有酶切位点SacI和PstI，引物送上海生物工程公司合成。正义目的片段扩增引物为：ZFP5(5一CTGCAGAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT一3酶切位点为：I)。ZFP3(5一GAGCTCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT一3酶切位点为：SacI)反义目的片段扩增引物为：ZMP5(5"-GAGCTCAGCGTGGTCG

7、CGGCCGAGGT一3酶切位点为：SacI)．ZMP3(5一CTGCAGTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT一3酶切位点为：PstI)。以甘蔗RNA的反转录产物cDNA为模板。采用TaqDNApolymerase进行PCR扩增。PCR扩增程序为94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72oC延伸1min，33个循环，72℃延伸10min。PCR产物经质量分数1％的琼脂糖电泳后，用AxyPrep